biotina și partenerul său de legare avidin sunt utilizate în mod obișnuit astăzi în biologia moleculară pentru o serie de tehnici și protocoale diferite. În acest post vom discuta despre rolul natural al biotinei, biotinilarea, descoperirea interacțiunii biotină-avidină și utilizările biotinilării în biologia moleculară!
Aflați mai multe despre biotinilarea in vivo a proteinelor de fuziune bacteriană
biotina este o vitamină esențială pentru viață
deși biotina este cunoscută cel mai frecvent pentru rolul său în biologia moleculară, Biotina (Vitamina H sau vitamina B7) este mai întâi o coenzimă esențială care este necesară tuturor organismelor pentru viață. Biotina este sintetizată doar de plante, majoritatea bacteriilor și unele ciuperci, astfel mamiferele trebuie să obțină vitamina prin surse externe. Oamenii absorb cea mai mare parte a biotinei de care au nevoie în intestinul subțire din microflora care locuiește acolo.
biotina este un cofactor care, în forma sa activă, este atașat covalent la situsul activ al enzimelor metabolice cheie, inclusiv biotin carboxilaza și decarboxilazele. Aceste enzime catalizează transferul grupărilor carboxil în acizi organici pentru a produce metaboliți celulari importanți. Biotina acționează ca un purtător carboxil de la un compus la altul. Aceste enzime dependente de biotină sunt esențiale pentru procese precum gluconeogeneza, lipogeneza, metabolismul aminoacizilor și transducția energiei.
Biotinilarea este procesul general prin care biotina este adăugată la o proteină sau macromoleculă. Biotina poate fi adăugată enzimatic sau chimic. Biotinilarea enzimatică are loc în mod natural în celule și este procesul prin care biotina este legată covalent de o lizină specifică la locul activ al unei enzime nou sintetizate. Biotin protein ligase (BPL) este responsabil pentru această modificare foarte specifică a proteinelor post-translaționale. Majoritatea organismelor au mai puțin de cinci enzime în întregul proteom care sunt biotinilate. În E. coli, de exemplu, BPL, BirA, este responsabil pentru biotinilarea unei singure lizine în întregul organism pe proteina purtătoare de biotină carboxil (BCCP).
descoperirea interacțiunii biotină-avidină
la sfârșitul anilor 1930 s-a observat că animalele hrănite cu o dietă cu albușuri de ou ar dezvolta leziuni ale pielii și alte probleme teribile de sănătate. Această boală a fost denumită” leziune a albului de ou ” și s-a stabilit că se datorează unei deficiențe a vitaminei H redenumită ulterior vitamina B7/biotină. Rănirea albului de ou ar afecta aceste animale chiar dacă dieta lor ar fi suplimentată cu biotină. Astfel, ceva din albușul de ou a sechestrat biotina de a fi absorbită. În 1940, Esmond E. Snell a reușit să purifice proteina responsabilă de legarea biotinei, avidina. Avidin a fost numit pe bună dreptate pentru pui,” aviară”, ou a fost purificat din. Snell a confirmat mai târziu că avidin a fost într-adevăr vinovatul în vătămarea albusului de ou prin hrănirea șobolanilor purificați avidin (Kresege și colab., 2004). Avidina este o glicoproteină care constă din patru subunități identice care pot lega fiecare o moleculă de biotină.
biotina și avidina au o afinitate extrem de puternică unul pentru celălalt. De fapt, legătura dintre ele este una dintre cele mai puternice interacțiuni necovalente proteine-ligand găsite în natură. Odată ce legătura este formată, aceasta nu este afectată de modificările pH-ului, temperaturii sau solvenților organici.
utilizările biotinei în biologia moleculară
biotina este o moleculă relativ mică, solubilă în apă, care nu interferează cu macromoleculele la care se adaugă. Biotina are, de asemenea, un lanț lateral expus care poate fi ușor manipulat pentru a face specii reactive fără a afecta situl de legare a avidinei. Cu toate aceste caracteristici, nu este surprinzător faptul că oamenii de știință au început să exploateze biotina și interacțiunea sa puternică cu avidina în scopuri de Biologie Moleculară și Biotehnologie.
odată ce o polipeptidă este biotinilată (mai multe despre aceasta mai jos) poate fi incubată sau coexprimată cu avidină sau o proteină similară din punct de vedere structural care a fost descoperită în anii 1960, strepavidina. Complexul biotină-avidină poate fi apoi utilizat și / sau manipulat în scopul propus de un om de știință. Două dintre cele mai frecvente utilizări ale biotinilării în laborator sunt experimentele de purificare a proteinelor și imunoprecipitare. Proteinele sau complexele biotinilate pot fi purificate cu ușurință folosind coloane sau margele care sunt acoperite cu avidină.
interacțiunea biotină-avidină a fost, de asemenea, adaptată pentru utilizarea în imunohistochimie și etichetarea anticorpilor. În aceste experimente, biotina este adăugată la un anticorp primar sau secundar care vizează proteina de interes sau respectiv anticorpul primar. Avidin legat de un reporter este apoi adăugat la reacție pentru o detectare ușoară. Site-urile multiple de legare a biotinei găsite pe avidină sunt, de asemenea, ideale pentru amplificarea semnalului în timpul acestor experimente. În timpul detectării, o enzimă reporter biotinilată care este pre-incubată cu avidină liberă poate fi adăugată la proba dvs. Orice site-uri libere de legare a biotinei de pe acest complex se pot lega de anticorpul dvs. biotinilat. Acest lucru creează o rețea mare de complexe biotină-avidină legate de proteina dvs. de interes, ceea ce duce la amplificarea semnalului reporter și la detectarea mai ușoară. Această strategie este denumită imunohistochimia complexului Avidin-biotină (ABC) (IHC). Pentru mai multe informații despre ABC și IHC consultați Ghidul Thermo Fisher Scientific.
există o serie de alte aplicații de biologie moleculară pentru biotină și avidină. O listă scurtă a altor aplicații comune și link-uri către lucrări și pagini web relevante sunt enumerate mai jos.
- EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays)
- ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
- Southern/Northern Blotting
- Cell surface labelling
- Attaching polypeptides to a substrate
- Flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS)
- In situ hybridization
Methods for biotinylating your macromolecule of interest
To utilize the natural binding of biotina și avidina, macromoleculele de interes trebuie mai întâi biotinilate. Oamenii de știință au dezvoltat mai multe metode de biotinilare chimică a macromoleculelor de interes atât in vitro, cât și in vivo.
reactivi de Biotinilare:
lanțul lateral expus al biotinei poate fi reticulat cu grupări funcționale de aminoacizi in vivo prin substanțe chimice specializate (reactivi de biotinilare). Există o varietate de reactivi de biotinilare disponibili care diferă în grupele funcționale sau reziduurile pe care le vizează, precum și solubilitatea lor și, prin urmare, diferiți reactivi sunt utili pentru biotinilare în micromedii diferite. Există, de asemenea, reactivi de biotinilare reversibili și clivabili pentru a ajuta la eluția specifică a proteinelor biotinilate. Pentru a vă ajuta să determinați ce reactiv de biotinilare să utilizați, consultați instrumentul de selecție a reactivului de Biotinilare Thermo Fisher Scientific.
AviTag și BirA:
proteinele pot fi, de asemenea, biotinilate prin exploatarea specificității E.coli BPL, BirA. Dacă vă amintiți, BirA biotinilează o singură lizină în întregul proteom E. coli. Folosind aceste cunoștințe, oamenii de știință au identificat secvența de aminoacizi 13 necesară pentru recunoașterea și biotinilarea BirA. Această secvență de 13 aminoacizi este denumită AviTag. Folosind AviTag, se poate eticheta o proteină de interes cu biotină prin simpla creare a unei fuziuni în care AviTag este adăugat fie la capătul N, fie la capătul C al proteinei. S-a demonstrat că BirA biotinilează în mod eficient proteinele care exprimă AviTag în bacterii, drojdii, insecte și celule de mamifere. Check out Kay și colab., 2009 pentru metode de biotinilare a proteinelor cu BirA.
puteți găsi plasmide care conțin atât AviTag, cât și BirA la Addgene!
etichetarea Oligonucleotidelor:
biotina poate fi adăugată la oricare capăt al unei secvențe ADN în timpul unei reacții în lanț a polimerazei (PCR) utilizând un primer biotinilat. Biotina poate fi, de asemenea, încorporată enzimatic în timpul PCR folosind un dUTP etichetat cu biotină. Există mai multe tipuri de etichete de biotină care pot fi adăugate la o oligonucleotidă în funcție de aplicația dvs. din aval. Oligonucleotidele etichetate cu biotină pot fi utilizate într-o multitudine de aplicații, inclusiv, dar fără a se limita la hibridizarea in situ, blotarea (nordică și sudică) și legarea de afinitate.
Fotobiotinilare:
Fotobiotina poate fi utilizată pentru a eticheta neselectiv ADN și ARN. Acetatul de fotobiotină constă dintr-o moleculă de biotină atașată la o grupare arilazidică fotoreactivă. Sub lumină vizibilă puternică, grupul arilazidic devine reactiv și formează o legătură cu acizii nucleici din apropiere (McInnes și colab., 1990). Fotobiotinilarea este uneori mai ușoară și mai puțin costisitoare decât alte metode enzimatice. Oamenii de știință au folosit în mod obișnuit această metodă pentru a atașa proteine sau polipeptide la un substrat solid (Holden și Cremer, 2003).
1. Chapman-Smith, A., & Cronan, J. E.” biologia moleculară a atașării biotinei la proteine; simpozion: nutriție, Biochimie și Biologie Moleculară a biotinei ” J. Nutr, 129 (2009a): 477-484. PubMed PMID: 10064313.
2. Chapman-Smith, A., & Cronan, J. E. ” biotinilarea enzimatică a proteinelor: o modificare post-translațională a specificității excepționale.”Tendințe în științele biochimice, 24.9 ( 1999b): 359–363. PubMed PMID: 10470036.
3. A spus, H. M. ” Biotina: Vitamina uitată.”Jurnalul American de Nutriție Clinică 75.2 (2002): 179-180. PubMed PMID: 11815306.
4. Nicole Kresge, R. D. S. și R. L. H. ” descoperirea lui Avidin de Esmond E. Snell.”J Biol Chem 279.e5 (2004). PubMed PMID: 20353954.
5. Kay, B., Thai, S., & Volgina, V. ” Biotinilarea proteinelor cu randament ridicat.”Metode Mol Biol, 498 (2009): 185-196. PubMed PMID: 18988027. PubMed PMCID Centrală: PMC3223083.
6. McInnes, J. L., Forster, A. C., Skingle, D. C., & Symons, R. H. ” pregătirea și utilizările fotobiotinei.”Metode în enzimologie 184 (1990): 588-600. PubMed PMID: 2388593
7. Holden, M. A., & Cremer, P. S. „modelarea activată de lumină a moleculelor etichetate cu coloranți pe suprafețe.”Jurnalul Societății Americane de Chimie 125.27 (2003): 8074-8075. PubMed PMID: 12837056.
8. Pan, J. feng, Liu, N. hua, Shu, L. yuan, & Sun, H. „aplicarea tehnologiei avidin-biotină pentru a îmbunătăți aderența celulară pe matrice nanofibroase.”Jurnalul de Nanobiotehnologie 13.1 (2015): 1–14. PubMed PMID: 25980573. PubMed PMCID Centrală: PMC4461904.
9. Huang, Q., Mao, Z., Li, S., Hu, J., & Zhu, Y. „o metodă non-radioactivă pentru detectarea ARN-ului mic prin blotting nordic.”Orez 7.1 (2014): 1-7. PubMed PMID: 26224555. PubMed PMCID Centrală: PMC4884002.
10. Boer, E. De, Rodriguez, P., Bonte, E., Krijgsveld, J., Katsantoni, E., Heck, A., … Strouboulis, J. „biotinilarea eficientă și purificarea cu un singur pas a factorilor de transcripție etichetați în celulele mamiferelor și șoarecii transgenici.”PNAS 100.13 (2003): 7480-5. PubMed PMID:12802011. PubMed PMCID Centrală: PMC164612.
11. Liou, Y.-R., Wang, Y.-H., Lee, C.-Y., & Li, P.-C. „Sortare celulară activată prin flotabilitate folosind microbule de albumină Biotinilate vizate.”PLoS ONE 10.5 (2015). PubMed PMID: 25993512. PubMed PMCID Centrală: PMC4439073.
12. Ludwig, L. B., Hughes, B. J., & Schwartz, S. A. „sonde Biotinilate în testul de schimbare a mobilității electroforetice pentru a examina interacțiunile specifice dsDNA, ssDNA sau ARN–proteină.”Cercetarea Acizilor Nucleici, 23.18 (1995): 3792-3793. PubMed PMID: 7479014. PubMed PMCID Centrală: PMC307283.
13. Howarth, M., & Ting, A. Y. ” imagistica proteinelor în celulele vii de mamifere cu Biotin ligază și streptavidină monovalentă.”Protocoalele Naturii 3.3 (2008): 534-545. PubMed PMID: 18323822. PubMed PMCID Centrală: PMC2671200.
14. Bloch, B. ” sonde Biotinilate pentru histochimie de hibridizare in situ: utilizare pentru detectarea ARNm.”Jurnalul de histochimie și Citochimie : Jurnalul Oficial al Societății de histochimie, 41.12 (1993): 1751-1754.PubMed PMID: 8245422.
resurse suplimentare pe blogul Addgene
- biotinilarea in vivo a proteinelor de fuziune bacteriană
- Aflați cum este utilizată biotina în Split-BioID: o metodă îmbunătățită pentru studierea interacțiunilor proteine-proteine
- Aflați cum poate fi utilizată biotina cu CRISPR