discuție
rezultatele noastre arată că, prin planificarea atentă, instruirea și standardizarea reactivilor și protocoalelor, o rețea transnațională de laborator are capacitatea de a produce rezultate consistente și comparabile ale testului HAI. Cele cinci laboratoare de sănătate publică și academice care au participat la acest studiu au făcut parte din PCIRN, care a fost dezvoltat pentru a crește capacitatea Națională a Canadei de a sprijini vaccinarea și alte cercetări privind gripa în cazul unei pandemii. Într-o situație pandemică, cu teste de gripă de mare volum, de înaltă presiune și dispersate geografic, standardizarea testului HAI va fi de o importanță capitală pentru a asigura comparabilitatea rezultatelor între laboratoare. Laboratoarele PCIRN au prezentat un standard ridicat de reproductibilitate în cadrul laboratorului, cu o precizie de 99,8% a duplicatelor (99.2% până la 100% pe laborator), 97,8% din titruri într-un interval de 2 ori pe parcursul zilelor de testare repetate (93,3% până la 100% pe laborator) și 91,1% din serurile de testare care prezintă reproductibilitate a titrului la fiecare repetare a Protocolului de șase teste (60% până la 100% pe laborator). Reproductibilitatea interlaboratorie a fost, de asemenea, ridicată, cu titruri mediane în toate replicile din cele patru laboratoare de nerefecție în limita a 2 ori a Laboratorului de referință pentru 100% din serurile testate. Pe bază de laborator, titrurile de 94,3% și 98.9% din probe cuantificate într-o singură diluție a Laboratorului de referință și, respectiv, a titrurilor de consens (intervale, 85% până la 100% și 95% până la 100%). Aceste procente îndeplinesc pragurile tipice de acceptabilitate pentru variabilitatea testului HAI (și anume, cel puțin 80% din eșantioane fiind în limita a 1 diluție a valorilor nominale și/sau a Mgt-urilor pentru toate testele ). Specificitatea testului HAI (100%) și sensibilitatea (87,5% până la 100%) în laboratoarele PCIRN s-au încadrat la fel de bine în criteriile de acceptare ale studiilor anterioare (adică., 100% din probele negative ar trebui să cuantifice ca fiind sub nivelurile de cuantificare și cel puțin 80% din probele pozitive ar trebui să cuantifice ca pozitive ).
pentru componenta intralaboratoare a variabilității testului HAI, repetabilitatea în laboratoarele PCIRN pare similară cu cea prezentată în alte studii (5, 22). Un avertisment al acestor studii anterioare a fost că nu au fost examinate mai mult de trei repetări, în ciuda practicilor comune de validare a testelor imune de examinare a șase sau mai multe teste repetate (24-27). Ca atare, nu este clar dacă datele lor sunt direct comparabile cu rezultatele determinate pe parcursul a șase teste din acest studiu. Cu toate acestea, constatarea noastră de 0% până la 6,7% (mediană, 0%) a testelor cu rezultate care diferă de mai mult de 2 ori față de cele ale altor repetări ale testelor pare comparabilă cu 4,8% până la 7,1% observate anterior într-un laborator (22) și 0% până la 15% (mediană, 2%) în nouă laboratoare (5).
constatările noastre privind reproductibilitatea titrului HAI ridicat între laboratoarele PCIRN dispersate geografic contrastează cu rapoartele anterioare care arată o variabilitate substanțială între laboratoarele internaționale care efectuează acest test (5, 6, 9-12). De exemplu, datele dintr-un studiu amplu de colaborare (11 laboratoare) au găsit GCV-uri pe eșantion variind de la 84% la 803% (media GCV pe virus de 138%, 155% și 261% ). Alte studii au raportat GCVs pentru probele H1N1 și H5N1 care au cuprins 95% până la 345% (11) și 22% până la 582% (6), iar GMT-urile au diferit între laboratoare de până la 80 de ori (11) sau de 128 de ori (9). În timp ce rapoartele anterioare au inclus adesea un număr mai mare de laboratoare participante decât studiul actual, chiar și atunci când doar șase laboratoare au contribuit cu date, media GCV interlaborator a fost de 83% pentru cinci eșantioane H1N1, 80% dintre acestea depășind o diferență de 4 ori între laboratoare (11). În schimb, studiul actual a arătat GCVs mediană pe virus de numai 39% și 17%, cu 95% din probe într-o diferență de 4 ori între laboratoare. Un eșantion a depășit diferența de 4 ori; titrul nu a fost cuantificabil pentru acest eșantion la un laborator și, prin urmare, cea mai mică valoare a fost atribuită mai degrabă decât măsurată. Dacă eșantionul respectiv ar fi omis din analize, valoarea maximă a VGC ar fi de 75,5%, ceea ce ar reprezenta o valoare mai mică decât valoarea minimă a VGC în alte studii. Deși eșantionul respectiv a arătat o variabilitate mai mare decât altele, acest interval de măsurare scăzut a apărut în general mai puțin precis decât intervalele mai mari. De exemplu, GCV a variat de la 43,4% la 156,4% la titruri cuprinse între 10 și 80, comparativ cu 11,1% la 53,1% la titruri mai mari (Fig. 3). O variabilitate mai mare cu titruri mai mici a fost, de asemenea, descrisă anterior (23) și a contribuit probabil la clasificări de seroprotecție incongruente în studiul actual pentru cele trei probe H1N1 cu titruri cele mai apropiate de pragul de 40 (titruri de consens de 22, 24 și 43). În ciuda acestui fapt, precizia diagnosticului seroprotecției în laboratoarele PCIRN a rămas ridicată în general (93,6% când s-au utilizat titruri de consens pentru a defini seroprotecția și 89,5% comparativ cu valorile de laborator de referință).
acordul ridicat al titrurilor HAI interlaboratoare în laboratoarele PCIRN se poate referi la armonizarea atentă a procedurilor de testare HAI și a reactivilor din PCIRN. Participanții la studiile anterioare care au arătat o variabilitate interlaboratoare ridicată au folosit în general metode de testare HAI care au variat între laboratoare. Variabilele de analiză considerate a contribui la variabilitatea rezultatelor au inclus cantitatea de virus adăugată, sistemul de cultură virală (de ex., ouă de pui embrionate versus cultură tisulară), durata tratamentului RDE, diluția serică inițială, tipul și vârsta RBC-urilor utilizate și timpul acordat pentru decantarea RBC (5, 11, 12). Surprinzător, totuși, când Wood și colab. cu condiția ca participanții la laboratoarele comerciale și publice implicați în testarea vaccinului gripal sezonier în Europa să aibă o procedură standard de operare detaliată de urmat și reactivi/materiale comune, aceștia au raportat că variația interlaboratorie nu a fost îmbunătățită semnificativ (10). Autorii au speculat că „variațiile tehnice locale” persistente, precum și diferiți furnizori RBC, ar fi putut afecta reproductibilitatea între laboratoare, dar au menționat că standardizarea ulterioară a depășit limitele fezabilității pentru studiul lor. Publicațiile ulterioare au interpretat aceste constatări ca indicând faptul că standardizarea testului HAI între laboratoare nu este, în general, o abordare fezabilă pentru armonizarea rezultatelor HAI în diferite laboratoare (8, 12) și cel puțin un grup a încercat să dezvolte un test HAI modificat și mai robust pentru a genera date mai fiabile și reproductibile (22).
în studiul actual, laboratoarele PCIRN au aderat strict la protocolul standard de testare HAI al Organizației Mondiale a sănătății, disponibil publicului, în care punctele supuse variațiilor tehnice sau interpretative au fost armonizate între laboratoare înainte de începerea studiului. Reactivi cheie (de exemplu, RDE, RBC, stocuri de virusuri) au fost obținuți de la aceiași furnizori pe cât posibil. În plus, restricționarea testării la un singur tehnolog la fiecare loc de testare a permis o standardizare sporită. Efectul posibil al utilizării mai multor personal în fiecare laborator nu a fost testat în acest studiu. Deși utilizarea mai multor operatori ar putea crește variabilitatea, singurul studiu care a examinat această posibilitate pentru testarea HAI nu a evidențiat nicio diferență semnificativă între rezultatele obținute de la doi operatori din același laborator (22).
variațiile potențiale între laboratoare în tulpinile virale cultivate pentru utilizare în test au fost reduse la minimum între laboratoarele PCIRN prin utilizarea stocurilor de semințe virale dintr-o singură sursă care au fost cultivate în aceeași linie celulară în condiții similare în toate laboratoarele. Speculăm că reproductibilitatea interlaboratoare ar putea fi supusă unor îmbunătățiri suplimentare dacă stocurile de lucru virale ar fi produse la nivel central și distribuite laboratoarelor participante. Importanța variațiilor tulpinilor virale pentru titrurile de evaluare a HAI este bine ilustrată de titrurile de 2 până la 3 ori mai mici demonstrate într-un studiu când testul HAI a utilizat o tulpină a/Cal pH1N1 comparativ cu reasortantul X179A care încă poseda hemaglutinine și neuraminidaze echivalente (11). Din păcate, stocurile nu au fost secvențiate ca parte a acestui studiu și, prin urmare, nu putem verifica dacă toate laboratoarele au folosit viruși cu secvențe identice de hemaglutinină. Chiar dacă au fost introduse variații minore de secvență prin propagarea locală a stocurilor de virus, variabilitatea între laboratoare în acest studiu a fost mică și, prin urmare, este greu de imaginat cum utilizarea stocurilor cu secvențe HA identice ar putea reduce și mai mult variabilitatea. Deși diferențele nu au depășit de 2 ori în acest mic set de eșantioane, variațiile minore ale secvenței HA introduse de propagarea locală a stocurilor virale ar putea fi o posibilă explicație pentru tendințele de subestimare a titrurilor H1N1 și supraestimarea titrurilor H3N2.
diverse studii au raportat o variabilitate interlaboratoare redusă a titrurilor HAI prin calibrarea rezultatelor în raport cu standardele internaționale (6, 11-13); cu toate acestea, astfel de standarde nu există pentru tulpinile actuale de virus gripal sezonier B și gripal A H3N2, iar deviația antigenică constantă a tulpinilor sezoniere care determină reformularea anuală a vaccinurilor poate necesita dezvoltarea continuă și validarea de noi standarde. În acest studiu, comparabilitatea interlaboratoare pare superioară celei obținute prin utilizarea chiar și a celor mai eficiente standarde de calibrare. De exemplu, după calibrarea cu IS 09/194, Wood și colab. (11) a raportat că diferențele maxime dintre Mgt în diferite laboratoare s-au diminuat de la 80 la 64 de ori (adică o valoare încă apreciabil mai mare decât valoarea maximă de 11 ori în studiul actual) și că intervalele de VGC între laboratoare s-au diminuat de la 95% la 345% (mediană, 105%) la 34% până la 231% (mediană, 109%)-adică mult peste intervalul de la 0% la 156% (mediană, 27%) observat în acest studiu. În mod similar, utilizarea înlocuirii este de 10/202 a diminuat GCV între laboratoare de la un interval de 108% la 157% la un interval de 24% la 144% pe cinci probe și diferențe maxime între laboratoare de la 43 de ori la 21 de ori (13) și, folosind standardul 07/150, Stephenson și colab. (6) a redus valoarea mediană a VGC de 15 probe NIBRG-14 H5N1 clade 1 de la 125% (interval, 31% la 582%) la 61% (34% la 535%).
în timp ce motivul(motivele) exact (E) pentru nivelul ridicat de acord între laboratoarele PCIRN în comparație cu studiile anterioare nu poate fi stabilit, succesul nostru a fost facilitat de stimulentul pe care l-am avut ca rețea națională de a lucra spre obiectivul comun de a stabili procese reproductibile. Armonizarea detaliată și riguroasă a proceselor și reactivilor între situri este poate singurul aspect” nou ” pe care l-am adus acestui studiu, în comparație cu corpul de literatură de lungă durată care arată o reproductibilitate slabă a HAI între laboratoare. Cu toate acestea, datele noastre sugerează că, cu o standardizare atentă, variațiile interlaboratoare ale titrurilor HAI pot fi reduse la niveluri similare cu cele observate în laboratoarele individuale. Următorii pași potențiali în minimizarea variațiilor titrurilor HAI în laboratoarele din întreaga lume ar fi mobilizarea rețelelor/consorțiilor, implementarea liniilor directoare și/sau a cerințelor de reglementare pentru utilizarea procedurilor și reactivilor standard, instruirea standardizată pentru a asigura reproductibilitatea și furnizarea de sprijin și/sau stimulente pentru laboratoare pentru a îmbrățișa conceptul de „standardizare”.