Actomyosin kontraktilitet skalor med myoblast töjning och förbättrar differentiering genom Yap nukleär export

myoblaster anta en långsträckt form för att differentiera och reglera deras aktinätverk till spridningsområdet

för att bedöma förhållandet mellan cellform, aktinätverk och fokala vidhäftningar odlade vi C2C12 myoblaster på ett homogent lager av fibronektin (FN). Efter 24 timmar i kultur fixerades och färgades myoblaster för aktin för att bestämma deras morfologiska parametrar (Fig. 1A). FN-belagda substrat möjliggjorde etablering av specifika cell-substratinteraktioner genom att rekrytera specifika transmembranintegriner. I själva verket uttrycks flera subenheter av integrin i sackaros som kombineras med subenhet av subenheten i sackaros1 under skelettmyogenes, vilket är viktigt vid MyoGen cellmigration, myoblastfusion,muskelfibermognad eller vid upprätthållande av muskelintegration32, 33. Ytterligare experiment utförda på laminin (LAM)-belagda substrat indikerade att båda morfologiska parametrarna (cellformindex, cellomkrets och cellområde, kompletterande Fig. 1a) och cell-substratinteraktioner (antal och område för fokala vidhäftningar, kompletterande Fig. 1B) var statistiskt lika på FN och LAM och validerade FN-beläggningen för att studera in vitro morfologierna för C2C12-myoblaster under fusions – /differentieringsprocessen.

vi kvantifierade cellformindexet (CSI) som kännetecknade myoblasternas morfologi genom att ge information om cellförlängningen. Rundade celler har en CSI nära 1, medan långsträckta celler har en CSI nära 0. Vi hittade CSI som sträcker sig från 0,1 till 0,8 med ett medelvärde på 0.37 0,15 (n = 101), vilket tyder på en stor variation i cellmorfologier (Fig. 1B). Myoblaster uppvisade en genomsnittlig omkrets på 259 22 82 (Fig. 1C, n = 101) och ett brett spektrum av spridningsområden (från ~1000 till ~4000 occurm2), med ett medelvärde av 2057 618 occurm2 (Fig. 1D, n = 101). Dessa fynd erhållna på C2C12-myoblaster förstärktes genom att utföra ytterligare morfologiska mätningar (CSI, cellomkrets och cellområde) på primära humana myoblaster (16ubic, kompletterande Fig. 2A) som kommer från biceps hos en patient som inte påverkas av FSHD (dvs. som har bekräftats sakna en 4QA-radering). Såsom visas i kompletterande Fig. 2B-d, våra resultat visar att CSI av 16ubic myoblaster varierade från 0.14 till 0.86 med ett medelvärde av 0.44 0.17 (n = 90), vilket tyder på en stor variation i cellmorfologier för humana myoblaster, som observerats för c2c12-celler. Sammantaget visar våra resultat att variationen i cellmorfologier inte är beroende av celltypen eller någon artefakt i cellkulturen.vi studerade sedan fördelningen av aktinfilament i en population av c2c12-myoblaster för att förstå om variabilitetsspridningsområdena kan modulera aktincytoskelettet. Våra resultat visade att den totala fluorescensintensiteten hos f-aktinnätverket var linjärt relaterad till cellområdet (Fig. 1E, n = 31, R2 = 0,748), vilket tyder på att ju större myoblastspridningen desto mer aktinfilament bildas. Såsom visas i kompletterande Fig. 3, karakteriserade vi nästa fördelningen av vinculin-innehållande vidhäftningar för att bestämma hur variationer av cellform påverkar cell-substratinteraktioner i C2C12-myoblaster. Vi fann att den totala ytan av cell-substratadhesioner per cell ökade med cellområdet (Fig. 1F, n = 31, R2 = 0,783) och med fluorescensintensiteten hos F-aktin (Fig. 1G). Våra resultat indikerar att c2c12-myoblaster antar en mängd olika cellformer och spridningsområden, men anpassar i sin tur både mängden aktinfilament och vinculin-vidhäftningar till deras spridning. För att få mer inblick i cellformens roll för myoblastdifferentiering, överväger vi nästa utvecklingen av cellformatförhållandet under proliferation (P0 vid 6 timmar och P2 vid 48 timmar) och differentiering (D2 vid 96 timmar) steg (Fig. 1H). Såsom visas i Fig. 1I, J, våra resultat visar att myoblaster ökade sitt bildförhållande från 0,40 0,16 (P0) till 0,36 0,09 (P2) och 0,24 0,07 (D2), vilket tyder på att myoblaster förlängs avsevärt och antar ett bildförhållande på 1:4 för att skilja. Dessutom indikerade våra resultat att aktinspänningsfibrerna var mycket orienterade vid D2 (kompletterande Fig. 4A, B), som också motsvarar betydande kärnförlängningar (kompletterande Fig. 4C). Sammantaget visar våra resultat att f-actin-nätverket moduleras genom modifieringar av myoblastmorfologin och indikerar att myoblastdifferentiering krävde cellulär förlängning upp till ett bildförhållande på 1:4.

den rumsliga organisationen av aktinätverket och kärnan styrs av myoblastmorfologin

vi kontrollerade den inneboende variationen i myoblastmorfologier genom att använda självhäftande mikromönster för att standardisera deras spridningsområden och kontrollera deras former. Genom att använda en microcontact printing technique20 skapade vi självhäftande mikromönster av fibronektin (FN) med ett konstant område på 1600 kcal m2 och olika geometrier. Vi använde avrundade (CSI = 1), kvadrerade( CSI = 0,79), triangulära (CSI = 0,60) och olika bildförhållanden av rektangulära (CSI = 0,50 och 0,34 för 1: 4 och 1:7 bildförhållanden, respektive) FN mikromönster till kultur enskilda myoblaster (Fig. 2A). Dessa olika geometrier av mikromönster tillåts standardisera in vitro myoblastformen över ett brett spektrum och för att kontrollera deras spridningsområde.

för att kvantitativt bestämma rollen för cellgeometrin på den rumsliga organisationen av aktincytoskelettet bestämde vi orienteringen av aktinfilamenten för varje cellform34, 35. Aktinfilament färgade med phalloidin färgkodades som en funktion av deras orientering med en färggradient som sträcker sig från ljusblå när aktinfilament organiserades parallellt (0 kg) till den horisontella axeln och rött (+90 kg) eller orange (-90 kg) för de som organiserades vinkelrätt mot den horisontella axeln (Fig. 2B). Vi observerade att aktinfilament i avrundade celler fördelades slumpmässigt, med orienteringar som sträcker sig från -90 kg till +90 kg. Kvadrerade celler uppvisade aktinfilament organiserade i tre huvudvinkliga domäner: 0° till 25°, 50° till 90° -50° till -90°, medan den triangulära celler visade aktin filament i huvudsak organiserad enligt tre sidor av mönster vid 0°, 60° -60°. Intressant nog fann vi att aktinfilament var mycket orienterade parallellt med den långa cellaxeln (0 msk) för rektangulära celler av 1:4 (CSI = 0,50) och 1:7 (CSI = 0,34) bildförhållanden. Kvantifieringen av vinculininnehållande vidhäftningar indikerade inga statistiska skillnader i vidhäftningsområden mellan cellmorfologier (kompletterande Fig. 5A-C), medan orienteringen av fokala vidhäftningar modulerades av cellform (kompletterande Fig. 5D, E), som observerats för aktinfilament. Våra resultat visar att både 1: 4 och 1: 7 rektangulära myoblaster tillåter en starkare organisation av aktincytoskelett (Fig. 2c) och fokala vidhäftningar, vilket tyder på att myoblastförlängning leder till bildandet av kontraktila dipoler.

Med tanke på cellkärnans roll i differentiering av myoblaster i myotubes undersökte vi nästa om förändringar i cellform och cytoskeletonarkitektur kan modulera kärnans form och orientering36. Vi fann att kärnformatförhållandet ökade signifikant med sänkning av CSI (Fig. 2D). Faktum är att rundade celler (CSI = 1) på cirkulära mikromönster visade en rundad kärna kännetecknad av ett genomsnittligt bildförhållande på 1,11 0,06, medan rektangulära celler med ett bildförhållande på 1:4 (CSI = 0,50) och 1:7 (CSI = 0,34) uppvisade stora kärndeformationer med bildförhållanden på 1,39 0,21 respektive 2,19 0,23. Vi märkte också att orienteringen av kärnan modulerades av cellmorfologin (Fig. 2E). Vi fann att orienteringen av kärnan i avrundade, kvadrerade och triangulära celler sträckte sig över ett brett spektrum av vinklar (från ~15 kg till ~60 kg), med en genomsnittlig orientering på ~40 kg (cirkulär, n = 11), ~33 kg (kvadrat, n = 14) och ~43 kg (triangel, n = 10) i förhållande till den horisontella axeln. För rektangulära celler indikerade våra resultat att kärnan var orienterad parallellt med cellaxeln med en genomsnittlig vinkel på ~14 kg (1:4, n = 15) och ~2 kg (1:7, n = 10).

cellförlängning förbättrar myoblastkontraktilitet

nästa fråga vi tog upp var hur förändringar i cellform påverkar myoblastkontraktilitet. För att svara på denna fråga använde vi dragkraftsmikroskopi (TFM) för att bestämma dragspänningarna som utövas av mikropatternerade myoblaster. Såsom visas i Fig. 3A vi observerade att de maximala spänningarna utövades vid extremiteterna hos de mikropatternerade myoblasterna, oavsett cellformen. Som tidigare observerats på andra celltyper37 ackumulerades den kontraktila spänningen företrädesvis i hörnen (kvadrater och trianglar) eller vid båda extremiteterna (1:4 och 1:7 rektanglar) av mikromönstrade myoblaster. Vi kvantifierade den totala stressen som utövas av enskilda mikropattererade myoblaster för att bestämma om cellmorfologin modulerar cellkontraktiliteten. Såsom visas i Fig. 3B, avrundade celler (CSI = 1) utövade en total stress på 170,7 26,4 46,4 N/m2, medan rektangulära celler (CSI = 0,34, bildförhållande 1:7) utövade en större total stress (295,9 156 156.8 N / m2), vilket tyder på att långsträckta cellformer leder till ökade dragspänningar. Vidare fann vi att rektangulära formade celler (CSI = 0.34, bildförhållande 1:7) uppvisade det större maximala spänningsvärdet (684.3 257.8 pa, Fig. 3C), medan avrundade myoblaster visade det lägsta maximala spänningsvärdet (351,5 kcal 123,6 Pa). Med tanke på att de kontraktila spänningarna utövades vid cellens periferi och att sänkning av CSI leder till ökade dragspänningar, ritade vi det maximala spänningsvärdet som en funktion av avståndet från masscentrum till cellens extremitet (Fig. 3D), som representerar 22,6 OC (CSI = 1), 28,28 OC (CSI = 0,79), 33,98 OC (CSI = 0,60), 41,23 OC (CSI = 0,50) och 53,45 OC (CSI = 0,34). Såsom visas i Fig. 3D fann vi att den maximala kontraktila spänningen ökade linjärt med avståndet från centroid till cellens extremitet (R2 = 0.958, n = 65), vilket tyder på att långsträckta morfologier av myoblaster utövar fler dragkrafter.

för att bestämma bidraget från aktomyosin-nätverket vid upprättandet av kontraktila krafter i myoblaster behandlades c2c12-celler med G-aktin-sekvestrerande läkemedel Latrunculin B (LatB) och med myosin II-hämmaren Blebbistatin (Bleb). Immunostained myoblasts med phalloidin indikerade att LatB och Bleb-behandlade celler uppvisade ett diffust aktinätverk (Fig. 3E), vilket visar att båda drogerna väsentligt påverkat organisationen av F-aktin. Vi använde TFM på mikropatternerade myoblaster behandlade med båda läkemedlen för att bestämma aktomyosinnätverkets roll vid upprättandet av kontraktila krafter i myoblaster med olika geometrier. Våra resultat tyder på att LatB-behandling inducerade en signifikant förlust av kontraktilitet, vilket ökade med cellförlängningen. Faktum är att rundade celler visade en förlust av kontraktil stress på ~62%, medan 1:4 och 1:7 rektangulära celler behandlade med LatB kännetecknades av en förlust av kontraktil stress på ~88% respektive ~86% (Fig. 3F). Dessutom fann vi att kontraktil stress av 1:4 rektangulära celler behandlade med Bleb kännetecknades av en förlust av ~80% av den kontraktila kraften, vilket visar att myosin II-molekylmotorer är nyckelaktörer av myoblastkontraktila krafter.

sammantaget indikerar dessa resultat att kontraktiliteten hos aktomyosin-nätverket förbättras i långsträckta myoblaster genom etablering av ett tätt nätverk av parallella aktomyosinfibrer.

cellparens kontraktilitet ökade efter deras fusion och höjdes på långsträckta mikromönster

för att förstå hur myoblastmorfologi kan påverka myotubes kontraktila egenskaper, anser vi en minimal modell av två myoblaster. Vi bestämde först dragkrafterna som utövas av celldubbletter vid P1 (24 h i spridningsmedier) pläterade på mikromönster av varierande former (kompletterande Fig. 6A). Det fanns inga statistiska skillnader i kontraktil stress mellan det breda utbudet av CSI (kompletterande Fig. 6B), trots en väldefinierad orientering av actin-nätverket (kompletterande Fig. 6C) och kärnorna (kompletterande Fig. 6D, E) på 1:4 och 1:7 rektangulära mikromönster. Baserat på denna observation kvantifierade vi sedan den kontraktila spänningen som utövas av celldubblar odlade på cirkulär (CSI = 1) och rektangulär (CSI = 0.50, 1:7 bildförhållande) FN-mikromönster under ytterligare fem dagar (D5, Fig. 1H) i differentieringsmedium. Vi använde MitoTracker Red CMXRos (ThermoFisher Scientific), en levande mitokondriell färgning, för att säkerställa att myoblast-dubbletter smältes (Fig. 4A) 38. Såsom visas i Fig. 4B, C, Vi fann att den totala kontraktila spänningen ökade något i smälta celldubblar som odlades på cirkulära mikromönster (267 64 pa) jämfört med cirkulära unfused celldubblar (157 37 pa), medan smälta långsträckta dubblar var mer än två gånger mer kontraktila (543 193 Pa) än unfused avlånga dubblar (211 73 pa). Dessa resultat indikerar att den cellulära kontraktiliteten ökade efter cellfusion och förbättrades signifikant för långsträckta morfologier.

Aktomyosinkontraktilitet främjar myotube-differentiering

vi frågade sedan om aktomyosinkontraktiliteten hos myoblaster kunde påverka myotube-differentiering. C2c12 myoblaster odlades på FN-belagda substrat i proliferationsmedia i 2 dagar (P2, Fig. 1H) för att nå den cellulära sammanflödet. Sedan tillsattes antingen LatB eller Bleb i 30 minuter och spridningsmediet ersattes av ett differentieringsodlingsmedium. Efter 4 dagar i differentieringsmedium (D4, Fig. 1H), c2c12-celler fixerades och färgades för DNA och TroponinT, en markör för differentiering (Fig. 5). Vi bedömde effekten av LatB-och Blebbehandlingar genom färgning av alfa-aktinin på kontrollmyotubes (CTRL) och myotubes behandlade med Latrunculin B (+LatB) och blebbistatin (+Bleb). Som observerats i kompletterande Fig. 7, kontrollera myotubes närvarande typiska striated Z-band mönster, medan LatB och Bleb behandlingar störa striation mönster i myotubes. Kontroll myotubes (CTRL) kännetecknades av ett genomsnittligt bildförhållande på 7,99 3,38 (Fig. 5A) och ett positivt Troponin T-område på 51,7 5,6% (Fig. 5B). Våra resultat tyder på att LatB-och Blebbehandlingar minskade fraktionen av Troponin T-området till 44,9 5,2% och 44,4 5,1%. Dessutom fann vi att fusionsindexet var statistiskt lägre för LatB (27 2CG 3%) och Blebb-behandlade (29 3CG 3%) celler än för kontrollceller (38 5cg 5%), vilket stärkte aktomyosinkontraktilitetens roll i myoblastdifferentiering (Fig. 5C). Sammantaget indikerade dessa resultat att aktomyosinkontraktiliteten hos myoblaster främjar myotube-differentiering.

myoblastförlängning utlöser Yap-nukleär export, vilket är väsentligt för differentieringen av myoblaster i myotubes

för att få mer inblick i de intracellulära mekanismerna som styr myotube-differentieringen, betraktar vi YAP: s roll genom att bestämma dess lokalisering i antingen cytoplasman eller kärnan i myoblaster, där den binder till och aktiverar myoblaster tead transkription faktorer39. För detta ändamål kvantifierade vi det cytoplasmatiska/nukleära Yap-förhållandet i mikropatternerade myoblaster (Fig. 6a och kompletterande Fig. 8). Cellförlängning på 1:4 och 1: 7 rektangulära mikromönster ökade det cytosoliska/nukleära Yap-förhållandet (Fig. 6B), vilket tyder på att cellförlängning utlöser Yap-nukleär export genom kärnkompressiva krafter som utövas av actomyosin-nätverket40. För att verifiera om lokaliseringen av YAP i antingen cytoplasman eller kärnan är relaterad till specifika steg i differentieringsprocessen färgade vi YAP i c2c12-celler efter 24 h (P1) och 48 h (P2) i proliferationssteget och vid 96 h (D2) och 264 h (D9) i differentieringssteget (Fig. 6c och kompletterande Fig. 9). Intressant visade våra resultat att cytoplasmatisk / nukleär Yap-förhållande ökade från 0,37 0,07 vid P1 till 0,68 0,06 vid P2 och 0,67 0,06 vid D2 och minskade sedan till 0,42 0,10 vid d9 (Fig. 6D). Intressant visade sig det cytoplasmiska / nukleära Yap-förhållandet vid D9 statistiskt inte skilja sig från P1-värden, vilket tyder på att det cytoplasmatiska/nukleära YAP-förhållandet i differentierade myotubes liknar det för myoblaster. För att verifiera dessa resultat skördade vi myoblaster vid proliferationssteget P1 (24 h) och differentieringssteget D2 (96 h) och vi isolerade deras cytoplasmatiska och kärnmaterial. Vi utförde en proteinanalys av bicinkoninsyra (BCA) och proteinerna i cytoplasmatiska och nukleära extraktioner analyserades genom elektrofores (Fig. 6E). Våra Western blot-fynd indikerade att det cytoplasmiska/nukleära Yap-förhållandet ökade från 0,62 0,08 0,08 vid P1 till 0,87 0,24 vid D2 (Fig. 6F). Denna biokemiska kvantifiering av YAP visade en betydande Yap-nukleär export för att differentiera c2c12-celler och stärka våra resultat.

baserat på dessa resultat bedömde vi YAP: s roll genom att använda leptomycin B för att blockera aktiv export från kärnan genom att direkt binda till exportin141. Faktum är att Alberto Elosegui-Artola och medarbetare nyligen har visat att leptomycin B (LMB) kan användas effektivt för att studera hur kontraktila krafter som utövas av cytoskelettet Driver Yap-kärntranslokation39. Genom att behandla c2c12-myoblaster vid P2 (48 h) med LMB fann vi att det cytoplasmatiska till nukleära Yap-förhållandet var signifikant lägre i LMB-behandlade celler vid D2 (96 h, Fig. 6G), vilket tyder på att YAP huvudsakligen koncentreras i kärnan när kärnkraftsexporten hämmas. Dessutom indikerade våra resultat att fusionsindexet vid D4 av LMB-behandlade celler (Fig. 6H) var mycket låg(3,8 1.5%) jämfört med kontrollceller (42,4 9,1% av de exporterade kärnenergiprodukterna (c2c12), vilket visar att det krävs aktiv kärnkraftsexport för differentiering av C2C12.