diskussion
bildcytometrimetoden som föreslås i detta arbete visar förmågan att snabbt och effektivt analysera autofagi i levande celler för screening av potentiella läkemedel som kan inducera eller hämma autofagiska aktiviteter, såsom att främja clearance av felveckade proteiner associerade med neurodegeneration eller hämma läkemedelsresistens associerad med cancer. Begränsning i de nuvarande metoderna kan övervinnas genom bildcytometri och unika reagens för att utveckla en ny metod för autofagidetektion. Cellometervisionen har tidigare använts för fluorescerande cellbaserade analyser (Chan et al., 2011, 2012b; Robey et al., 2011), och Cyto-ID-autofagfärgämnet har visat sig specifikt fläcka autofagosomer i levande celler. I detta arbete visas Cyto-ID-färgämnet att colocalize med RFP-LC3 i svältade HeLa-celler, vilket ytterligare validerar färgämnets specificitet. Den utvecklade bildbaserade autofagidetekteringsmetoden benchmarkeras mot standardflödescytometri genom att jämföra autofagiaktiviteten resulterar i näringsämnen som svälter Jurkatceller. Resultaten visade en ökning av fluorescerande intensitet i näringshungade celler och en minskning för återvunna Jurkatceller. De uppmätta AAF-värdena för bildcytometri är emellertid betydligt högre än flödescytometri, vilket kan bero på skillnader mellan instrumentering och metoder. Cellometerns Synbildcytometer använder en laddningskopplad anordning för fluorescensmätning, medan FACS Calibur-flödescytometern använder ett fotomultiplikatorrör (PMT). Dessutom skilde sig metoden för att analysera fluorescerande intensiteter också mellan de två systemen. Flödescytometern mäter totala fluorescenssignaler från varje cell, medan det bildbaserade systemet förvärvar bilder och analyserar fluorescerande färgade autofagosomer i cellerna, vilket kan ge mer exakta mätningar av autofagiaktivitet. Cellometerprogramvaran kan analysera fluorescens av celler genom att summera de totala fluorescerande pixlarna i varje cell, eller mäta endast de höga fluorescerande intensitetspixlarna från autofagosomer i varje cell. En annan skillnad kan orsakas av skjuvspänning av flödescytometri som påverkar målcellernas livskraft (Robey et al., 2011).
Autofagflöde är också en viktig analys för att utveckla en ny detektionsmetod. CQ används för att hämma lysosomal nedbrytning av autofagosomer, där den autofagiska aktiviteten skulle vara den högsta för näringsämnen-svalt Jurkat celler i närvaro av CQ på grund av synergistisk interaktion mellan behandlingarna. Den näst högsta skulle vara Jurkatceller i svält utan CQ. Endast en liten ökning av autofagisk aktivitet skulle uppvisas av Jurkat-celler med CQ endast i jämförelse med kontrollen på grund av ackumulering av basala autofagolysosomer. De autofagiska flödesresultaten erhållna från båda instrumenten visade liknande trender, men AAF-värdena uppmätta i bildcytometri är signifikant högre. Dessa resultat visade att bildcytometrisk detektionsmetod lätt kunde implementeras för att undersöka autofagiaktivitet, trots de potentiellt instrumentspecifika kvantitativa skillnaderna i AAF-värdena.
för att visa att bildcytometri kan vara en potentiell screeningteknik för läkemedelsupptäckt måste förmågan att analysera prover under flera förhållanden testas. Bildcytometri används för att mäta autofagisk aktivitet hos Jurkat-celler behandlade med rapamycin i olika koncentrationer, för att visa förmågan för bildcytometri att mäta dos–responseffekter över en tidskursstudie. Som ett resultat kan bildbaserad cytometri detektera skillnaderna i autofagisk aktivitet över olika experimentella förhållanden. I Fig. 8.6, den autofagiska aktiviteten (mätt med AAF-värden) är den högsta efter 18 timmars inkubation. En liten minskning av AAF-värden visas mellan 8 och 4 h inkubation, vilket kan bero på att cellerna inte kan återhämta sig helt efter den initiala läkemedelsbehandlingen. Dessutom kan vidhäftande celler såsom den humana prostatacancercellinjen (PC-3) också mätas med hjälp av bildcytometrimetoden. Bildupplösningen av Cellometersyn kan analysera fluorescerande märkta autofagosomer (puncta), observerade i både fluorescerande bilder och fluorescensintensitetshistogram.
det är också viktigt att visa förmågan att karakterisera olika läkemedelsföreningar genom att jämföra deras autofagiska dos–responseffekt för läkemedelsupptäckningskampanjer. Dos-responseffekter av tamoxifen och rapamycin jämförs direkt med bildcytometri. Resultaten vid 18 timmars inkubation visade att rapamycin inducerade en högre nivå av autofagiaktivitet än tamoxifen. Det är viktigt att notera att tamoxifen vid 100 kg är mycket cytotoxiskt, vilket leder till Jurkat celldöd och sönderfall efter 18 timmars inkubation. Den bildbaserade verifieringen av cytotoxicitetseffekt i tamoxifen vid hög koncentration kan vara mycket användbar för att eliminera osäkerheter från endast scatter-plot-och histogramresultat.
Bildcytometri har visat jämförbara resultat med standardflödescytometri för fluorescerande cellbaserad analys (Chan et al., 2011; Robey et al., 2011). Bildbaserad cytometri metod kan erbjuda flera fördelar jämfört med flödescytometri. Till exempel är antalet celler som krävs för varje prov (10-20 UCL) signifikant mindre än en konventionell flödescytometer (300-500 UCL). Den initiala inställningen på flödescytometern kräver att några av målcellproverna används för PMT-spänningar och kompensationsjustering. Å andra sidan pipetterar många bildcytometrar celler i en räkningskammare som kan skannas om flera gånger. Därför slösas inte målcellsprover bort under den initiala optimeringen av exponeringstidsjustering och fokusering. Ännu viktigare är att fördelen med att fånga BR och fluorescerande bilder gör det möjligt för forskare att visuellt verifiera förvärvade fluorescensdata. Detta kan hjälpa till att identifiera cytotoxicitet som en komplicerande bieffekt av en läkemedelsbehandling analys som inducerar autofagi.
Autofluorescens kan uppstå med Cyto-ID grön autofagi färgämne på grund av plasträkningskammaren, men programvaran kan automatiskt ta bort bakgrundssignalen för att erhålla den faktiska målfluorescensen utan att ändra AAF-beräkningen. Dessutom minimeras fotoblekning av fluorescerande sonder i cellbaserade analyser eftersom Cellometersyn använder lysdioder med lägre effekt jämfört med de högeffektlasrar som används i andra instrument. Framtida förbättring av Cellometerbildcytometern skulle vara att utveckla ett automatiserat system med högre genomströmning som kan analysera fler celler för förbättrad statistisk analys, liksom förmågan att analysera flera prover samtidigt, vilket underlättar cellbaserad läkemedelsscreening med högre genomströmning av hämmare och aktivatorer av autofagi, apoptos, nekros och andra fysiologiska fenomen av intresse.