DNA trippel helixbildning: ett potentiellt verktyg för genetisk reparation

*motsvarande författare: D. V. Kohli
Institutionen för farmaceutiska vetenskaper vetenskap, Dr. Hari Singh Gour Vishwavidyalaya, Sagar-470 003, Indien
e-post:

Abstract

DNA triple helices offer new perspectives towards oligonucleotide-directed gene regulation. Trippel helixbildande oligonukleotider, som binder till dubbelsträngat DNA, är av särskilt intresse eftersom de är riktade mot själva genen snarare än till dess mRNA-produkt (som i antisensstrategin). Den dåliga stabiliteten hos vissa av dessa strukturer kan dock begränsa deras användning under fysiologiska förhållanden. Specifika ligander kan interkalera i DNA-trippelheliker och stabilisera dem. Denna översyn sammanfattar de senaste framstegen inom detta område samtidigt som man lyfter fram stora hinder som återstår att övervinna innan tillämpningen av triplex-teknik på terapeutisk genreparation kan uppnås.

trippel helixbildning (fig. 1) nyligen har varit i fokus för stort intresse på grund av möjlig tillämpning vid utveckling av nya molekylärbiologiska verktyg samt terapeutiska medel och på grund av den möjliga relevansen av H-DNA-strukturer i biologiska system . I intermolekylära strukturer binds en oligopyrimidin-oligopurinsekvens av DNA-duplex av en tredje sträng oligonukleotid i huvudspåret .

två huvudtyper av trippelhelices har beskrivits, beroende på orienteringen av den tredje strängen . De första rapporterade trippel-spiralformade komplexen involverade pyrimidisk tredje sträng vars bindning vilar på Hoogsteen vätebindningar mellan ett T-A-baspar och tymin och mellan ett C-G-baspar och protonerat cytosin . Den (T, C)-innehållande oligonukleotiden binder parallellt med oligopurinsträngen i det så kallade pyrimidinmotivet. En andra kategori av trippelhelices innehåller puriner i den tredje strängen, som är orienterad antiparallell med oligopurinsträngen. C·G×G och T·A×bas trillingar bildas efter en omvänd Hoogsteen väte bindning systemet . Oligonukleotider innehållande T och G kan också bilda tredubbla spiraler vars orientering beror på bassekvensen .

trippelhelixbildning erbjuder ett direkt sätt att selektivt manipulera genuttryck i celler där DNA-trippelhelices erbjuder nya perspektiv mot oligonukleotidriktad genreglering (fig. 2). Syntetisk trippelhelixbildande oligonukleotider (TFOs) binder med hög affinitet och specificitet till purinsträngen i huvudspåret i homopurin – homopyrimidinsekvensen i dubbelsträngat DNA .

TFOs är bra kandidater för att användas som platsspecifika DNA-bindande medel och de undersöks för deras användning som potentiella terapeutiska medel. De har studerats i antisensapplikationer, där de är utformade för att rikta mRNA, antigenapplikationer, där de kontrollerar genuttryck via trippelhelixbildning, och i applikationer som riktar sig mot proteiner, där de används som aptamers .

TFOs kan också användas i genterapi där de riktar sig mot DNA-sekvens av muterad gen för att förhindra dess transkription. Purinrika områden finns ofta i genpromotorregioner och TFO: er riktade till dessa regleringsställen har visat sig selektivt minska transkriptionen av de riktade generna, sannolikt genom att blockera bindning av transkriptionsaktivatorer och/eller bildning av initieringskomplex. Triplex-medierad modulering av transkription har potentiell tillämpning i terapi eftersom den kan användas; till exempel för att minska nivåerna av proteiner som anses vara viktiga i sjukdomsprocesser. TFOs kan också användas som molekylära verktyg för att studera genuttryck och de har visat sig vara effektiva i olika genmålstrategier i levande celler. TFOs kan binda till polypurin / polypyrimidinregioner i DNA på ett sekvensspecifikt sätt. Specificiteten av denna bindning ökar möjligheten att använda triplexbildning för riktad genommodifiering, med det ultimata målet att reparera genetiska defekter i humana celler. Flera studier har visat att behandling av däggdjursceller med TFOs kan framkalla DNA-reparation och rekombination, på ett sätt som kan utnyttjas för att införa önskade sekvensförändringar. Ett antal studier har rapporterats där oligonukleotider användes som antigenföreningar i cellerna .

bildning av trippelhelix-DNA

trippelhelixbildning är ett resultat av oligoinukleotider som binder med en hög specificitet av igenkänning till huvudspåret av dubbelhelikulärt DNA genom att bilda Hoogsteen-typbindningar med purinbaser av Watson-Crick-basparen, föreningen rationellt utformad för artificiell reglering av genuttryck . Triplexbildning kräver Mg2 + joner medan den hämmas av K+ joner.

i trippelhelixen eller antigenstrategin binder oligonukleotiden i huvudspåret av dubbelsträngat DNA via Hoogsteen vätebindning för att bilda en trippelhelix . TFOs binder homopurin-homopyrimidinsekvenser i dubbelsträngat DNA. Det finns fyra strukturella motiv för triplexbildning som har beskrivits baserat på den tredje strängkompositionen och dess orientering i förhållande till den purinrika strängen i duplexen. Purinmotiv TFOs (de som består av G och A) bildar G*G:C och A*A:T tripletter och binder i antiparallell orientering med avseende på purinsträngen i duplexen. Å andra sidan bildar pyrimidinmotiv TFOs (C/T) triplexer i parallell orientering och i allmänhet endast vid lågt pH på grund av nödvändigheten av att cytosinbaserna protoneras för att bilda Hoogsteen-bindningar; de bildar C+*G:C och T*A:T tripletter. Slutligen binder blandad purin och pyrimidin TFOs i antingen parallell eller antiparallell orientering och bildar G*G:C och T*A:T tripletter. Orienteringen i vilken det blandade motivet tfos Binder, är beroende av antalet GPA-och ApG-steg i homopurinkanalen . Den antiparallella orienteringen gynnas av ett större antal steg, medan ett lågt antal steg gynnar parallellorienteringen .

När det bästa motivet för bindning av en viss målsekvens har fastställts begränsar problem med naturliga fosfodiesteroligonukleotider framgången för antigenmetoden och de terapeutiska tillämpningarna av oligonukleotider i allmänhet. Oligonukleotider med den naturliga fosfodiester-ryggraden är mottagliga för endo-och exonukleaser. Den dominerande aktiviteten som försämrar oligonukleotider är 3 ’ – exonukleasaktivitet, men endonukleasaktivitet har också observerats i vissa inställningar . Således måste tfos för applicering som terapeutika in vivo kunna motstå både exonukleas-och endonukleasaktivitet för att nå sitt mål. En ryggradsmodifiering som ger nukleasresistens men tillåter bindning till dubbelsträngat DNA med hög affinitet krävs för in vivo-tillämpningar av TFOs.

Fosforodiamidatmorfolinooligomerer är modifierade ryggradsoligonukleotider som tidigare har undersökts som antisensmedel . Morfolinoligonukleotider har en oladdad ryggrad i vilken DNA – deoxiribossockret ersätts av en sexledad ring och fosfodiesterlänkningen ersätts av en fosforodiamidatbindning (fig. 3). Morfolinoligonukleotider är resistenta mot enzymatisk nedbrytning och verkar fungera som antisensmedel genom att arrestera översättning eller störa pre-mRNA-Splitsning snarare än genom att aktivera RNAs H . De har framgångsrikt levererats till vävnadsodlingsceller med metoder som fysiskt stör cellmembranet, och en studie som jämför flera av dessa metoder fann att skrapbelastning var den mest effektiva leveransmetoden; emellertid, eftersom morfolino-ryggraden är oladdad, katjoniska lipider är inte effektiva mediatorer av morfolino oligonukleotidupptag i celler . En ny rapport visade triplexbildning av en morfolino-oligonukleotid och på grund av den icke-joniska ryggraden visade dessa studier att morfolino-oligonukleotiden kunde triplexbildning i frånvaro av magnesium .

katjoner har visat sig spela en viktig roll vid trippel helixbildning. När fosfodiesteroligonukleotider används som TFOs krävs magnesium i allmänhet för triplexbildning med purin och blandat motiv TFOs; det påskyndar också reaktionen och stabiliserar triplexen bildad med pyrimidinmotiv TFOs . Andra tvåvärda katjoner har visat sig fungera i samma kapacitet som magnesium med avseende på triplexbildning . Magnesium uppträder i en koncentration av ~0,8 mM i cellen och ~1,5 mM i blodet , men de flesta In vitro-triplexreaktioner utförs i 5-10 mM MgCl2. Kalium uppträder i cellen i en koncentration av ~140 mM och vid 4 mM i blodet. Höga koncentrationer av kalium kan hämma triplexbildning med guaninrika oligonukleotider utformade som TFOs genom att gynna andra sekundära DNA-strukturer, såsom dimerer och fyrdubblar . Det kommer att vara nödvändigt att övervinna fosfodiester TFOs begränsade förmåga att bilda en triplex i lågt magnesium och högt kalium för att de ska vara effektiva under fysiologiska förhållanden. I en ny studie av morpholino TFOs demonstrerades triplexbildning i frånvaro av magnesium och i närvaro av kalium. Dessa egenskaper gör morpholino TFOs bra kandidater för vidare studier som antigene therapeutics.

molekylär modellering

DNA-triplexstruktur kan konstrueras med molekylära modelleringstekniker genom att använda koordinater som korrekt tar hänsyn till sockerkonformationen av (T,C)-motiv trippelhelices . Denna struktur är närmare ett B-form-DNA som rapporterats av NMR-studier jämfört med den föreslagna strukturen , baserad på fiberröntgendiffraktion. JUMNA-programmet tillåter konstruktion av DNA-strukturer enligt deras spiralformade parametrar . En interkaleringsplats kan enkelt skapas i triplexen genom att fördubbla stigningsparametern för två intilliggande T·A T-bas tripletter (rise = 6,8 kg) och därefter minska vridparametern mellan dessa två tripletter från 34 till 16 kg för att minska bindningsavståndsbegränsningarna.

med hjälp av molekylär modellering kan man visa möjligheten att bilda en parallell trippelhelix i vilken enkelsträngen interagerar med den intakta duplexen i det mindre spåret via nya basinteraktioner .

JUMNA använder en blandning av spiralformiga och interna koordinater (Valens och dihedrala vinklar) för att beskriva nukleinsyraflexibilitet. De spiralformade parametrarna placerar varje 3 ’ monofosfatnukleotid med avseende på ett fastaxelsystem. Korsningar mellan successiva nukleotider upprätthålls med kvadratiska begränsningar på O5′-C5’ avstånd. Förutom ett minskat antal variabler med avseende på kartesiska koordinatprogram möjliggör valet av fysiskt meningsfulla variabler stora, samordnade konformationella rörelser under minimering, tillsammans med en effektiv kontroll av strukturen och enkel introduktion av begränsningar eller begränsningar. Tillgängliga verktyg inkluderar både adiabatisk kartläggning och kombinatoriska sökningar med avseende på valda strukturella parametrar. Särskilda egenskaper hos Flex force-fältet inkluderar närvaron av en specifik term för att redogöra för vinkelberoende av vätebindning och möjligheten till elektrostatisk energiscreening med en sigmoidal dielektrisk funktion , XHamster (R) =D-(D-D0)/2 exp (-RS), där R är avståndet mellan två laddningar. Lutningen S, platåvärdet på långdistans D och funktionens initialvärde D0 är justerbara, med standardvärden på 0,16,80 respektive 1,med hjälp av två antaganden som redan används för att konstruera minor-groove triple helix . För det första är bas tripletterna fasthållna för att vara coplanar för att undvika eventuella Interbase triplettinteraktioner. Sådana interaktioner bildas lätt under konstruktionen av sträckta spiraler men kan inte spela en roll i erkännande eller strängutbyte, eftersom dessa processer är oberoende av den totala sekvensen. Det har kontrollerats att den optimerade strukturen hos minor-groove triplex är oberoende av dessa begränsningar. Det andra antagandet, i linje med stökiometri av RecA/ DNA-komplex, som visar tre nukleotider per RecA-monomer, är användningen av trinukleotid spiralformad symmetri. Av denna anledning har preliminära studier begränsats till sekvenser med trinukleotidrepetition.

specifika begränsningar eller begränsningar behövs för triplex konstruktion och manipulation. Dessa inkluderar” platå ” begränsningar och trinukleotidsymmetri begränsningar, som beskrivits tidigare . ”Plateau” -fasthållningen upprätthåller samplanariteten hos baserna som bildar en triplett, samtidigt som de rotationer och förskjutningar som krävs för basparbyte tillåts. Trinukleotidsymmetribegränsningen innebär ekvivalensen av variablerna som beskriver varje successiv grupp av tre nukleotider. Sträckning dsDNA, så att vridningen minskar och det mindre spåret öppnas har tidigare uppnåtts genom att begränsa avståndet mellan de terminala O3′ – atomerna i trinukleotidsymmetrienheten. Denna återhållsamhet har modifierats något eftersom O3′ – O3 ’ – avståndet kan ändras genom en sidoförskjutning av ryggraden under strängbyte. I ett nyligen verk begränsades endast komponenten i O3’-O3 ’ – vektorn parallellt med helixaxeln. Begränsningarna på spårbredden, kalibrerade med hjälp av numeriska Poisson-Boltzmann elektrostatiska beräkningar, användes för att undvika spårminskning på grund av bristen på explicita lösningsmedelsmolekyler .

basparkoppling studeras genom basrotation, med användning av metoden definierad av Bernet et al . Detta innebär en återhållsamhet som appliceras på vinkeln på den mellan glykosidbindningen (purin: C1′-N9 eller pyrimidin: C1′-N1) och vektorn som förenar de två C1′ – atomerna i ett baspar, projicerat på planet vinkelrätt mot en lokal spiralformad axel. i det kanoniska B-DNA: t har den ett värde av 55. Modelleringsbaspar omkoppling för en vald bas innebär en adiabatisk variation av Macau från 65 till 10.

hinder och begränsningar som uppstår vid trippel helixbildning

biologiska tillämpningar av TFOs äventyras av grundläggande biofysiska överväganden, liksom begränsningar som åläggs av fysiologiska förhållanden. Triplexbildning innebär tillvägagångssätt och bindning av en negativt laddad tredje sträng till en dubbel-negativt laddad duplex. Neutralisering av laddningsavstötning tillhandahålls vanligtvis experimentellt av nivåer av Mg++ (5-10 mM) som är mycket högre än vad som tros vara tillgängligt i celler . Vidare involverar triplexbildning konformationsförändringar på den tredje strängens sida och viss snedvridning av den underliggande duplexen . Pyrimidinmotivtriplexer är instabila vid fysiologiskt pH på grund av kravet på cytosinprotonation som uppträder vid relativt surt pH (pKa = 4,5). Detta är nödvändigt för den andra Hoogsteen vätebindningen, även om den resulterande positiva laddningen uppenbarligen ger det viktigare bidraget till triplexstabiliteten . Pyrimidinmotivtriplexer som innehåller intilliggande cytosiner är ofta mindre stabila än de med isolerade cytosiner. Traditionellt har detta tillskrivits laddningsavstötningseffekter, även om en ny studie tyder på ofullständig protonation av intilliggande cytosiner kan vara den kritiska faktorn . Dessutom kan purinmotiv tredje strängar (som är G-rika) bilda g-tetrader i fysiologiska nivåer av K+, vilket hämmar triplexbildning . Alla dessa faktorer påför kinetiska hinder på triplexbildning och minskar stabiliteten hos triplexer som en gång bildats (de flesta triplexer, även under optimala förhållanden in vitro, är mindre stabila än den underliggande duplexen .

strategier för att motverka begränsningarna

det första och främsta problemet som uppstår i trippelhelikal antigenstrategi är instabiliteten hos triplexen som bildas av TFO: erna under fysiologiska förhållanden som följaktligen begränsar användningen av denna mycket fascinerande strategi avsedd för genkorrigering i varierande utsträckning. Därför har olika tillvägagångssätt och strategier föreslagits för att ge stabilitet till den tredubbla spiralformade strukturen som bildas.

Oligonukleotidstyrda trippelhelices kan stabiliseras genom att använda nukleinsyraligander som selektivt stabiliserar trippelhelices. Till exempel har etidiumbromid visat sig binda och stabilisera en trippelhelix Tillverkad av poly (dT)·poly (dA) bisexuell poly (dT), som endast innehåller T·A T-tripletter . Emellertid stabiliserar denna förening dåligt (eller till och med destabiliserar) de tredubbla spiralerna som innehåller både T·A-T och C·G-C+ – bas tripletter, troligen som ett resultat av elektrostatisk repulsion . Bensopyridoindolderivat var de första molekylerna som rapporterades starkt stabilisera denna senare typ av trippelhelices trots att de har en preferens för T·A-T-sträckor . Flera andra intercalatorer såväl som olika DNA-mindre spårligander har också visat sig binda till DNA-trippelhelices. Till exempel trippelhelices kan stabiliseras genom kemisk modifiering av oligonukleotider såsom, psoralen fäst vid oligonukleotider har visat sig förbättra sin biologiska aktivitet efter UV-bestrålning . Intercalators stabiliserar vanligt i större utsträckning trippelhelices som innehåller T * A T Triplets, eftersom mindre spårbindemedel destabiliserar vanligt triplexes, utom i ett bestämt fall, var den tredubbla spiralen involverade en RNASTRÄNG . Eftersom inga strukturella data finns tillgängliga på trippelhelix-ligandkomplex, är inte mycket känt om interaktionerna som leder specifik interkalering till trippelheliker. BPI-derivat har visat sig interkalera mellan T * A-T-bas tripletter genom excitationsfluorescensenergiöverföring från bas tripletter till ligander och genom linjär och cirkulär dikroism . Pyrimidinparallella morfolinoligonukleotider befanns kunna bilda en triplex med duplexmål. Som förväntat krävde detta motiv ett lågt pH för triplexbildning, vilket krävs av pyrimidinparallellmotivfosfodiester TFO. Det kan vara möjligt att övervinna detta pH-beroende med sådana substitutioner som 5-metylcytosin för cytosinerna i TFO .

ett alternativt tillvägagångssätt genom vilket trippelhelices kan stabiliseras är via kemiska modifieringar av oligonukleotider, såsom kovalent bindning av en akridinmolekyl . Det har visats att akridinsubstitution starkt ökar inhiberingen av restriktiv enzymklyvning och det försämrar inte sekvensspecificitet för triplexbildning .

tillämpningar av Triple Helix DNA

bildandet av intermolekylära DNA triple helices erbjuder möjligheten att utforma föreningar med omfattande sekvensigenkänningsegenskaper, som kan vara användbara som antigenmedel eller verktyg i molekylärbiologi . Under det senaste decenniet har ett nytt tillvägagångssätt med användning av DNA-analoger, som terapeutiska medel, dykt upp i medicinsk kemi. Detta är baserat på att reglera uttryck av gener av sjukdomsrelaterade proteiner / enzymer genom att blockera deras transkription (antigen) eller översättning (antisense) (fig. 4). Det påverkas genom sekvensspecifik bindning av komplementära oligonukleotider till antingen DNA-duplex via triplexbildning för att hämma produktionen av mRNA eller störa översättningen av det senare till proteiner. Eftersom oligonukleotider inte lätt kommer in i celler och är mottagliga för destruktion av cellulära nukleaser, utformas, syntetiseras och utvärderas en mängd kemiskt modifierade analoger av oligonukleotider för utveckling som terapeutiska medel.

det specifika erkännandet av homopurin-homo pyrimidinregioner i duplex-DNA genom triplexbildande oligonukleotider (TFOs) ger en attraktiv strategi för genetisk manipulation, med det ultimata målet att reparera genetiska defekter i mänskliga celler. Förmågan att rikta mutationer kan vara användbar, som ett verktyg för att studera DNA-reparation, och som en teknik för genterapi och genteknik .

effektiva verktyg baserade på trippelhelices utvecklades för olika biokemiska tillämpningar, såsom utveckling av mycket specifika artificiella nukleaser. Antigenstrategin är fortfarande ett av de mest fascinerande områdena för triplex-applikation för att selektivt kontrollera genuttryck (Tabell 1). Inriktning av genomiska sekvenser har nu visat sig vara ett värdefullt koncept på ett fortfarande begränsat antal studier; lokal mutagenes är i detta avseende en intressant tillämpning av triplexbildande oligonukleotider på cellkulturer .

Table 1: Antigen Nukleinsyrastudier inom eukaryota Celler80

Antigenstrategier fokuserar främst på geninriktning genom homolog rekombination eller genom trippelhelixbildande oligodeoxynukleotider . Av många tekniska skäl, inklusive mycket begränsad gentillgänglighet inom den mycket malariakondenserade, proteinförpackade kromosomstrukturen, har den kliniska tillämpningen av dessa metoder inte utvecklats snabbt. Kielkopf et al har nyligen beskrivit ett alternativt tillvägagångssätt, med användning av polyamider som kan diffundera in i kärnan och känna igen specifika DNA-sekvenser . Även om det är mycket spännande, är denna metod fortfarande i sin linda och dess ultimata kliniska nytta är fortfarande okänd .

terapeutiska tillämpningar av antigenteknik

Triple helix DNA har väckt uppmärksamhet på grund av potentiell tillämpning av TFOs som terapeutiska medel, för applicering såsom intracellulär geninriktning, som rationella kemiska lösningar för att sekvensera specifikt erkännande av en DNA-duplex och identifiering av gener som är ansvariga för celltillväxt och malign transformation . Med denna kunskap har kommit en naturlig önskan att översätta denna information till nya, målspecifika terapeutiska strategier för behandling av cancer, hjärt-kärlsjukdomar och andra vanliga sjukdomar hos mänskligheten (Tabell 2). Den senaste utvecklingen av en relativt specifik biokemisk hämmare av BCR / abl-proteintyrosinkinas hos patienter med kronisk myelogen leukemi är ett fantastiskt exempel på detta uppdrag . För terapier som syftar direkt till ersättning, reparation eller inaktivering av sjukdomsframkallande gener har framstegen varit mycket långsammare och en framgång som motsvarar den biokemiska BCR/abl-hämmaren har ännu inte uppnåtts. Orsakerna till detta är komplexa och varierar med vilken typ av genriktad terapi som används .

tabell 2: vissa sjukdomar som är mottagliga för behandling med DNA-Terapi

Stephenson och Zamecnik visade att en kort (13nt) DNA-oligonukleotid omvänd komplementär i sekvens (antisense) till Rous sarkomviruset kan hämma viral replikering i kultur. En av de viktigaste egenskaperna hos antisense-och antigenoligonukleotider i deras användning som terapeutika är deras nukleasresistens. Fosforotioatoligonukleotider är den vanligaste typen av oligonukleotider som har relativt hög nukleasresistens och har introducerats på marknaden som läkemedel mot cytomegalovirusinducerad retinit . Oligonukleotider med en 2′-O,4′ – C-etylen nukleinsyra (ENA) Rest vid den andra positionen från 3 ’ – änden visar mycket högre nukleasresistens än de med en låst nukleinsyra (LNA) Rest vid samma position .

Även om Kurreck et al rapporterade att lna-oligonukleotider var stabila i humant serum , var delvis modifierade ENA-oligonukleotider mycket mer nukleasresistenta än LNA-oligonukleotider i råttplasma. Dessutom visar oligonukleotider som är sammanhängande modifierade med ENA-rester vid 3′ och 5′ – änden mer stabilitet än de som delvis modifierats. Således har ENA-oligonukleotider hög potential som antisense-och antigenmedel som kan användas in vivo . Sekvensspecifik triplexbildning kan appliceras för geninriktning, gentystning och mutagenes .

framtidsutsikter

oligonukleotider kan binda plats-specifikt till en målgen av intresse genom trippel helixbildning. Triplexbildande oligonukleotider är för närvarande utformade för att binda till HER-2 (human epidermal growth factor receptor 2)/ neu-genen, en gen som är överuttryckt i en mängd olika humana tumörer, inklusive icke-småcellig lungcancer, bröstcancer, äggstockscancer och GI-tumörer. Denna strategi kommer att vara allmänt tillämplig för att förhindra uttryck av många onkogener eller andra cancerrelaterade gener. Dessa” antigen ” oligonukleotider används nu för att leverera DNA-alkylerande medel till specifika baser i HER-2 / neu-promotorn och kodande sekvens för att förhindra transkriptionsinitiering och förlängning. I synnerhet har triplexbildande oligonukleotider använts för att leverera kväve senap, såsom klorambucil, till en specifik guaninbas i HER-2/neu-genen för att förhindra genuttryck. Målspecifik Anti-cancerstrategi som involverar antigenoligonukleotider kopplade till DNA-aktiva läkemedel kommer att visa sig vara en milstolpe inom en snar framtid.

1. Thuong, NT och Helene, C., Angew. Chem. Int., 1993, 32, 666
2. Mirkin, S. M. och Frank-Kamenetskii, M. D., Annu. Rev. Biophys.Biomol. Struct., 1994, 23, 541.det är en av de mest populära och mest populära i världen. Syra. Res., 2002, 30, 5407.
3. Sun, J. S. och Helene, C., Curr. Opin. Struct. Biol., 1994, 3, 345.det är en av de mest populära metoderna för att hitta en ny produkt. Syra. Res., 1987,15, 7749.
4. Moser, He och Dervan, Pb, Science, 1987, 238, 645.
5. Beal, P. A. och Dervan, P. B., Vetenskap, 1991, 251, 1360.
6. Pilch, D. S., Levenson, C. och Shafer, R. H., biokemi, 1991, 30,6081.Duval-Valentin, G., Sun, J. S., Bisagni, E., Garestier, T. och Helene, C., Nucl. Syra. Res., 1996, 24, 1136.
7. McGuffie, E. M. och Catapano, C. V., Nucl. Syra. Res., 2002, 30,12, 2701.
8. Basye, J., Trent, J. O., Gao, D. och Ebbinghaus, S. W., Nucl. Syra.Res., 2001, 29, 4873.
9. Helene, C. och Toulme, J. J., Biochem. Biophys. Acta., 1990,1049, 99.
10. Helene, C., Eur. J. Cancer, 1994, 30, 1721.
11. Stein, C. A. och Cheng, Y. C., Vetenskap, 1993, 261, 1004.
12. Wagner, RW, Natur, 1994, 372, 333.det finns många olika typer av läkemedel. Biophys.Acta., 1999, 1489, 181.det är en av de mest populära och mest populära i världen. Sci., 1991, 313, 585.
13. Gamper, H. B. J., Kutyavin, I. V., Rhinehart, R. L., Lokhov, S. G.,Reed, M. W. och Meyer, R. B., biokemi, 1997, 36, 14816.
14. Eder, P. S., DeVine, R. J., Dagle, J. M. och Walder, J. A., AntisenseRes. Dev., 1991, 1, 141.
15. Fisher, T. L., Terhorst, T., Cao, X. och Wagner, R. W., Nucl. Syra.Res., 1993, 21, 3857.
16. Stein, D., Foster, E., Huang ,S. B., eller AcidDrugDev., 1997, 7, 151.
17. Summerton, St AcidDrugDev., 1997, 7, 63.
18. Summerton, Antis AcidDrugDev., 1997, 7, 187.
19. Hudziak, R. M., Barofsk. AcidDrugDev., 1996, 6,267.
20. Ghosh, C., Stein, D., eller, 2000, 313, 135.
21. Giles, R.V., Spiller, D.G., Clark, R.E. and Tidd, D.M., AntisenseNucl. AcidDrugDev., 1999, 9, 213.
22. Ghosh, C. and Iversen, P.L., AntisenseNucl. AcidDrugDev.,2000, 10, 263.
23. Lacroix, L., Arimondo, P.B., Takasugi, M., Helene, C. and Mergny,J.L., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, 270, 363.
24. Rougee, M., Faucon, B., Mergny, J.L., Barcelo, F., Giovannangeli, C.,Garestier, T. and Helene, C., Biochemistry, 1992, 31, 9269.
25. Maher, L.J., Dervan, P.B. and Wold, B.J., Biochemistry, 1990, 29,8820.
26. Singleton, S.F. and Dervan, P.B., Biokemi, 1993, 32, 13171.det är en av de mest kända och mest kända av de mest kända och mest kända av de mest kända och mest kända av de mest kända av de mest kända och mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända och mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända av de mest kända. Syra. Res., 1999, 27, 695.
27. Darnell, J., Lodish, H. och Baltimore, D., i; molekylär Cellbiologiscientific American Books, New York, 1990, 531.
28. Suda, T., Mishima, Y., Asakura, H. och Kominami, R., Nucl. Syra.Res., 1995, 23, 3771.
29. Olivas, WM och Maher, lj, Nucl. Syra. Res., 1995, 23, 1936.
30. Svinarchuk, F., Cherny, D., Debin, A., Delain, E. och Malvy, C., Nucl.Syra. Res., 1996, 24, 3858.
31. Faruqi, A. F., Krawczyk, S. H., Matteucci, MD och Glazer, p. m., Nucl. Syra. Res., 1997, 25, 633.
32. Blume, S. W., Guarcello, V., Zacharias, W. och Miller, D. M., Nucl.Syra. Res., 1997, 25, 617.
33. Ouali, M., Letellier, R., Adnet, F., Liquier, J., Sun, JS, Lavery, R. ochtaillandier, E., biokemi, 1993, 32, 2098.
34. Macaya, R. F., Schultze, P. och Feigon, J., J. Amer. Chem. Soc.,1992, 114, 781.
35. Radhakrishnan, I. och Patel, DJ, biokemi, 1994, 33, 11405.
36. Arnott, S., Bond, P. J., Selsing, E. Och Smith, P. J. C., Nucl. Syra.Res., 1976, 3, 2459.
37. Lavery, R. och Sklenar, H., J. Biomol. Struct. Dyn., 1988, 6, 63.
38. Bertucat, G., Lavery, R. och Prevost, C., J. Biomol. Struct. Dyn.,1998, 16, 535.
39. Lavery, R., Peyrard, M., Red. I; icke-linjär Excitation ibiomolekyler, Springer-Verlag, Editions de Physique, Berlin och NewYork, 1995, 57.
40. Hingerty, B. E., Richtie, R. H., Ferrell, T. L. och Turner, J. E., biopolymerer, 1985, 24, 427.
41. Bernet, J., Zakrzewska, K. och Lavery, R., J. Mol. Struct.Theochem., 1997, 398-399, 473.
42. Pesco, J., lax, J. M., Vigo, J. och Viallet, P., Anal. Biochem.,2001, 290, 221.
43. Gilbert, D. E. Och Feigon, J., Curr. Opin. Struct. Biol., 1990, 9, 305.
44. 50. Shimizu, M., Konishi, A., Shimada, Y., Inoue, H. och Ohtsuka, E.,FEBS. Lett., 1992, 302, 155.
45. Asensio, J. L., Carr, R., Brown, T. och Lane, A. N., J. Amer.Chem. Soc., 1999, 121, 11063.
46. Asensio, J. L., Lane, A. N., Dhesi, J., Bergqvist, S. och Brown, T., J. Mol. Biol., 1998, 275, 811.
47. Volker, J. och Klump, H. H., biokemi., 1994,33, 13502 .
48. Sugimoto, N., Wu, P., Hara, H. och Kawamoto, Y., biokemi.,2001, 40, 9396.
49. Arimondo, P. B., Garestier, T., Helene, C. och Sun, J. S., Nucl. AcidRes., 2001, 29, 15.
50. Michael, M., Seidman, M. M. och Peter, M. G., J. Clin.Investera., 2003,112, 487.
51. Panas Scaria, P. V. och Shafer, R. H., J. Biol. Chem., 1991, 266,5417.det är en av de mest populära och mest populära. Syra. Res., 1991, 19, 1521.
52. 59. Mergny, J. L., Duval-Valentin, G., Nguyen, C. H., Perrouault,L., Faucon, B., Rougee, M., Montenay-Garestier, T., Bisagni, E. andHelene, C., vetenskap, 1992, 256, 1681.
53. Lee, J. S., Latimer, L. J. P. och Hampel, K. J., biokemi, 1993, 32,5591.
54. Park, yw och Breslauer, kj, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1992, 89, 6653.
55. Durand, M., Thuong, NT och Maurizot, J. C., J. Biol. Chem., 1992,267, 24394.
56. Durand, M., Thuong, NT och Maurizot, JC, J. Biomol. Struct.Dyn., 1994, 11, 1191.
57. Kulka, M., Smith, C. C., Aurelian, L., Meade, K., Miller,P. och Ts ’ o, P. O. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6868.
58. Chang, E. H., Miller, P. S., Cushman, C., Devdas, K., Pirolo, K. F., Ts ’ op. O. p. och Yu, Z. P., Biokemi, 1991, 30, 8283.
59. Pilch, D. S. och Breslauer, K. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1994, 91, 9332.han är en av de mest kända och mest kända i världen., Garestier, T. och Helene, C., J. Mol. Biol., 1993, 232, 926.
60. Kim, S. K., Sun, J. S., Garestier, T., Helene, C., Bisagni, E., Rodger, A. och Norden, B., biopolymerer, 1997, 42, 101.
61. Lin, S. B., Kao, C. F., Lee, S. C. och Kan, L. S., AnticancerDrugDes., 1994, 9, 1.
62. Grigoriev, M., Praseuth, D., Robin, P., Hemar, A., Saison-Behmoaras, T., Dautry-Varsat, A., Thuong, N. T. och Helen, C., Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 1991, 88, 3389.
63. Grigoriev, M., Praseuth, D., Robin, P., Hemar, A., Saison-Behmoaras, T., Dautry-Varsat, A., Thuong, N. T., Helen, C. och Harel-Bellan,A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 267, 3389.
64. Gowers, D. M. och Fox, K. R., Nucl. Syra. Res., 1999, 27, 1569.
65. 73. Han är en av de mest kända och mest kända i världen.Syra. Res., 2003, 15, 31.
66. Melton, D. W., BioEssays, 1994, 16, 633.
67. Helene, C., Cancer, 1994, 30, 1721.
68. Majumdar, A., Khorlin, A. och Dyatkina, N., Nat. Genet., 1998, 20,212.
69. Kielkopf, C. L., Baird, E. E. Och Dervan, P. B., Nat. Struct. Biol.,1998, 5, 104.
70. Alan, M. och Gewirtz, M. D., J. Clin. Oncol., 2000, 18, 1809.
71. Rao, N. R. och Nalluri, B. N., Ind. J. Pharm. Edu., 2003, 37, 132.
72. Varmus, H. E., I. Biosci. Rep., 1990,10,413.
73. Fearon, E. R. och Dang, C. V., nuvarande Biol., 1999, 9, R62.
74. Hahn, W. C., Counter, C. M. och Lundberg, A. S., Nature, 1999, 400 464.
75. Druker, B. J. och Lydon, N. B., J. Clin. Investera., 2000, 105, 3.
76. Stephenson, M. L. och Zamecnik, P. C., Proc. Natl. Acad. Sci.USA., 1978, 75, 285.
77. gear ge farmakokinetik.,2002, 41, 255.
78. Morita, K., Hasegaw Med. Chem.Lett., 2002, 12, 73.
79. Kurreck, nu syra.Res., 2002, 30, 1911. det är en av de mest populära och mest populära i världen. Syra. Res., 2003, 31, 3267.