Dubbel blockad av CD47 och HER2 eliminerar radioresistenta bröstcancerceller

cellinjer

Human bröstcancer MCF-7, mda-MB-231, BT474, BT549, SKBR3 cellinjer, glioblastom U251 och koloncancer HCT116 cellinjer köptes från ATCC. MCF-7, mda-MB-231, BT474, BT549 och U251-celler bibehölls i DMEM-medium kompletterat med 10% FBS och SKBR3-celler bibehölls i RPMI-1640-medium med 10% FBS. Hct116-celler bibehölls i McCoys 5a-Medium med 10% FBS. De radioresistenta MCF7 / C6-och MDA-MB-231/C5-cellinjerna som klonades från överlevande fraktioner av MCF7−och MDA-MB-231-celler efter upprepad bestrålning; de HER2-överuttryckande bröstcancerstamcellerna (HER2+/CD44+/CD24 – /låga BCSC) isolerades från MCF7/C626. Mus trippelnegativ bröstcancer 4T1-celler bibehölls i DMEM-medium med 10% FBS. Human monocyt THP – 1 odlades i ATCC-formulerade rpmi-1640 medium kompletterat med 10% FBS, 15 mM HEPES, 4,5 g/l glukos, och 2-merkaptoetanol till en slutlig koncentration av 0,05 mm. mus m 264. 7 celler odlades i DMEM-medium med 10% FBS efter med ATCC-odlingsmetoden. Alla cellinjer testades negativ mykoplasma-kontaminering med MycoSensor PCR-Analyssats (Agilent Technologies, katalog # 302108).

plasmider och reagenser

CD47 promotorstyrd luciferasvektor konstruerades genom kloning av den humana CD47 promotorregionen (-1554 nt) till pGL2-basisk plasmid från kpni / Hind III-platser. Raderingen av de förmodade NF-kB-bindningsställena (TGGAAGCT-764-757) utfördes med användning av ett snabbt mutationssats (Stratagene, La Jolla, CA). Primersekvenserna som används: 5 ′-GTGGTCGGGTACCTGCCCGCTCGCCCCTCGCGGGCTCTGCG-3′ (sense) and 5 ′-CGCAGAGCCCGCGAGGGGCGAGCGGGCAGGTACCCGACCAC-3′ (antisense).

pGL2-NF-κB-luc plasmid was constructed with the 3 NF-κB-binding sites: GTGGGTTCCC, TCGCCACTCCCC, and TGGAAAGTCCCC by blunt-end ligation. IMD-0354 (Catalog # I3159) and TNF-α (Catalog # T0157) were purchased from Sigma. The lentiCRISPR v2 vector was purchased from the Addgene plasmid repository (Catalog # 52961). Herceptin was obtained from the UC Davis Comprehensive Cancer Center Pharmacy as left-over medicine (Genentech, NDC 50242-132-01). Lapatinib (katalog # S1028) köptes från Selleckchem. Anti-CD47 (B6H12) antikropp för IHC, ICC och western blot köptes från Santa Cruz (katalog # sc-12730). Anti-CD47-FITC för flödescytometri köptes från BD Biosciences (katalog # 556045). Anti-human CD47 (B6H12) antikropp för fagocytosanalys extraherades från b6h12.2-hybridom (ATCC 2 HB-9771 2. Anti-mus CD47 antikropp för in vivo tumörhämning extraherades från miap301 hybridom tillhandahålls av Dr William Frazier (Washington University School of Medicine). Anti-CD11b-antikropp för IHC-färgning köptes från Invitrogen (katalog # MA5-17857). Musmonoklonal Anti-tubulin-antikropp för western blot köptes från Sigma-Aldrich (katalog # T6074). Musmonoklonal Anti-bronkialaktinantikropp för western blot köptes från Sigma-Aldrich (katalog # A5441). Anti-HER2 / ERBB2 (katalog # 29d8) antikropp för IHC-färgning och western blot köptes från Cellsignaleringsteknik (katalog # 2165). Anti-HER2-APC-antikropp för flödescytometrianalys köptes från BD Biosciences (katalog # 340554).

Immunoblotting

proteiner från celler eller tumörvävnader extraherades i RIPA-lysbuffert (Pierce) kompletterat med proteas-och fosfatashämmare cocktail (cellsignalering). Proteinkoncentrationen bestämdes med användning av BCA-analysen (Pierce). Lysater denaturerades sedan och prover innehållande 30 occurg-proteiner utsattes för elektrofores i 10% SDS-poly-akrylamidgel, följt av överföring till polyvinylidendifluoridmembran (Bio-Rad). Efter blockering med 5% icke-fet torrmjölk exponerades membranet för den primära antikroppen och inkuberades vid 4 kcal C över natten. Blottar visualiserades genom märkning med HRP-kopplade sekundära antikroppar (Sigma-Aldrich) och inkubation med Amersham ECL western blotting detection reagent (katalog # RPN2106). Blots utvecklades på en Konica SRX101A-utvecklare och kvantifierades med ImageJ.

Flödescytometrianalys

uppsamlade celler sköljdes med PBS innehållande 0,5% BSA i PBS och cellpelletsna inkuberades med fluorescensmärkta primära antikroppar vid 37 kcal C under 30 min, följt av tvättning tre gånger med 0,5% BSA/PBS. Alla antikroppar titrerades för att optimera tillståndet innan de applicerades på experimentet. Flödescytometrianalys utfördes med användning av FACS Canto II cytometer (BD) och efterföljande analys utfördes med användning av FlowJo (Tree Star, Ashland, eller, USA) programvara. Gatingstrategierna baserades på FSC-och SSC-egenskaper och sattes upp för positiva cellpopulationer i FITC, APC-kanaler.

mänskliga bröstcancervävnader

färskfrysta HER2 positiva och negativa bröstcancervävnader tillhandahölls av UC Davis Comprehensive Cancer Center Biorepository (IRB # 283665 och IRB # 218204) finansierade av UC Davis Comprehensive Cancer Center Support Grant (CCSG) som tilldelades av National Cancer Institute (NCI P30CA093373) med all patientinformation blockerad utom diagnostiska resultat. Ytterligare humana bröstcancerpatologiska prover inklusive de ostainerade 4-oc-tjocka sektionerna av formalinfixerad paraffininbäddad (FFPE) parad primär bröstcancer och återkommande bröstcancer erhölls från Institutionen för patologi, Ohio State University med forskning IRB-godkännande (#2002h0089).

immunohistokemi (IHC)

Immunohistokemiskt färgning gjordes på 4-oc-tjocka FFPE-vävnadssektioner. I korthet deparaffiniserades glidbanorna och rehydrerades, och antigener hämtades i 40 minuter i en citratbuffert (pH 6.1) vid 95 kcal C. Endogen peroxidasaktivitet blockerades med 3% H2O2-lösning. Den primära antikroppsinkubationen gjordes vid 4 msk C över natten, följt av VECTASTAIN ABC Kit (Vector Laboratories) vid RT i 30 minuter enligt tillverkarens instruktioner. Reaktionsprodukterna detekterades med användning av Peroxidasubstrat Kit och motfärgades med hematoxylin (Vektorlaboratorier). Två ledande patologer var ansvariga för diagnosen av bröstcancer i kliniken och utvärderingen av experimentella tumörer. CD47-uttrycket utvärderades med användning av både färgningsintensitet och procent av färgade celler. Färgningsintensiteten graderades som 0: negativ; 1: svag; 2: måttlig; 3: stark. Högt uttryck definierades som stark färgningsintensitet i mer än 25% av tumörcellerna; medeluttryck var måttlig färgningsintensitet i mer än 25% av tumörcellerna; lågt uttryck var svag färgningsintensitet i mer än 25% av tumörcellerna eller måttlig färgning i <25% av tumörcellerna med hjälp av ASCO-CAP-riktlinjer63 användes för tolkning av HER2 immunhistokemi (IHC), och HER2-proteinuttryck fick poäng som negativ IHC 0 (ingen färgning eller membranfärgning som är ofullständig och är svag/knappt märkbar och inom 10% av de invasiva tumörcellerna i membranfärgning som är svag/knappt märkbar och inom >10% av de invasiva tumörcellerna) ; tvetydig IHC 2+ (omkretsmembranfärgning som är ofullständig och/eller svag/måttlig och inom >10% av de invasiva tumörcellerna; och eller fullständig och omkretsmembranfärgning som är intensiv och inom 10% av de invasiva tumörcellerna i 20% av den); positiv IHC 3+ (omkretsmembranfärgning som är fullständig, intensiv i mer än 10% av de invasiva tumörcellerna). Om resultaten var tvetydiga (2+) utfördes reflextestning med användning av in situ hybridisering (ISH). Vid detektering av CD47-uttryck av in vivo bestrålade tumörer avlägsnades behandlade mustumörer och fixerades i 4% paraformaldehyd i PBS under 24 timmar. proverna dehydratiserades med serie etanol (70%, 95% och 100%) under 48 timmar innan de inbäddades i paraffinlösningen (Polysciences).

immunocytokemi (ICC)

celler såddes på runda täckglas och odlades till 60-80% sammanflöde, följt av sköljning med PBS, fixering i 4% paraformaldehyd (pH 7,2) och permeabilisering med 0,1% Triton X-100 i PBS. Cellerna inkuberades sedan i en blockerande lösning i 15 minuter före inkubation med den primära antikroppen över natten vid 4 kcal C med 1:250 utspädningar. Celler inkuberades med tr-eller FITC-konjugerade sekundära antikroppar utspädda 1:1000 i blockeringslösningen under 1 h vid rumstemperatur i mörkret och analyserades med konfokalmikroskopi.

identifiering av strålningsassocierade antigena proteiner

C57 / B6-mus användes som en immuniseringsvärd med 5 106 106 mcf7/C6-celler i 0.1 ml volym injiceras vid basen av svansen eller fotplattan per mus, följt av att öka med samma volym celler vid 14: e dagen. Vid 5: e–7: e dagen efter den andra utmaningen avlivades mössen och serumet uppsamlades för att detektera antigena molekyler uttryckta i radioresistenta BC-celler. För att skilja RAAPs från icke-specifika molekyler uttryckta i normala bröstepitelceller och mcf7-celler av vildtyp utfördes ett förreningsförfarande med det råa serumet genom följande steg. Två miljoner humana normala bröstepitelceller MCF10A bereddes i en lösning innehållande 1 mm EDTA/PBS utan trypsin för att undvika att smälta några av de känsliga proteinerna, följt av sköljning med PBS två gånger. Cellerna pelleterades och lossnade sedan genom att knacka på rörets botten följt av tillsats av 1 ml musanti-sera och rotera vid 4 kg C i 2 timmar. blandningen centrifugerades sedan vid 9391 kg g i 5 minuter vid 4 kg C och supernatanterna uppsamlades, vilket upprepades en gång. Det första rengjorda antiserumet rengjordes ytterligare genom inkubation med vildtyp MCF7-celler med samma procedurer och upprepades sex gånger. Det slutliga renade antiserumet testades sedan av western blot mot proteinlysat från MCF10A-celler, MCF7− celler, MCF7/C6 och RD-BCSC-celler som sorterades efter bröstcancerstamcellsmarkörer HER2+/CD44+/ CD24-såväl som aldehyddehydrogenas (ALDH)64. CD47 och HER2 tillsammans med andra RAAPs i de radioresistenta BC-cellerna identifierades av western blots eller genom immunutfällning av membranproteiner renade från RD-BCSC-celler och de eluerade fraktionerna analyserades via LC/MS.de resulterande membranrapparna grupperades med ett antal proteiner och proteinfunktionella kategorier.

CRISPR redigering av HER2 och CD47

sgRNAs designades enligt instruktionen publicerad av Dr. Zhang Labs CRISPR design software (http://crispr.mit.edu) och det etablerade protokollet som har beskrivits i föregående publikation65. Fyra Oligos utformades motsvarande de mänskliga sgRNAs syntetiserades och klonades in i lenticrispr v2 vektor efter Zhang Lab GeCKO poolade library amplification protocol. För att minimera möjligheten till icke-specifik inriktning syntetiserades och testades tre sgrna-oligos av varje inriktningsgen. SgRNA med den bästa knockout-effektiviteten bestämd av western blotting valdes för efterföljande experiment. Sgrna-sekvenserna användes för mänskliga och musceller enligt följande:

hHer2gRNA_F: CACCGCGGCACAGACAGTGCGCGTC

hHer2gRNA_R: AAACGACGCGCACTGT CTGTGCCGC

hCD47gRNA_F: CACCGTAAATATAGATCCGGTGGTA

hCD47gRNA_R: AAACTACCAC CGGATCTATATTTAC

mHer2gRNA_ F: CACCGTGATGGCCCTCGCCCCTCGG

mHer2gRNA_ R: AAACCCGAGGGGCGAGGGCCATCAC

mCD47gRNA_F: CACCGCCCTTGCATCGTCCGTAATG

mCD47gRNA_R: AAACCATTACGGACGATGCAAGGGC

The lentiviral particles were generated using 293T cells following the protocol from Addgene. For gene editing, the isolated BCSC sphere cells or MCF7/C6 cells were trypsinized into single cells and plated 1. 2.5 × 105 cells/0.5 ml per well in the 12-well plates. Efter inkubation i 12 timmar tillsattes 1 ml virusinnehållande supernatant med 8 ng polybren till cellerna följt av inkubation i 6 timmar. sedan tillsattes 0,5 ml ytterligare regelbundet medium innehållande 10% värmeinaktiverat FBS och odlades ytterligare över natten. Infektionsmediet ersattes med 2 ml färskt medium med 10% FBS och odlades för 72 h. celler passerades till 60 mm vävnadsodlingsrätter och valdes genom odling i 0,3 occurg/ml Puromysin i 1 vecka och knockout av den riktade genen verifierades genom immunoblotting.

Luciferasanalys

celler transfekterades med Pgl2-basic-CD47 eller pGL2-basic-CD47-ACTUBICNF-kB eller pgl2-NF-kB luciferasreportrar, och luciferasaktivitet mättes med Luminometer (Promega, Madison, WI). För normalisering av reporter-transfektionseffektiviteten mättes den totala proteinkoncentrationen av lysater med BCA-Proteinanalyssatsen (Pierce, Rockford, IL) med BSA som standard.

kromatin immunoprecipitation (ChIP) analys

celler var tvärbundna med formaldehyd (1% slutlig) under 10 min, tvättades med iskall PBS och samlades i SDS-lysbuffert (1% SDS, 10 mm EDTA, 50 mM Tris, pH 8. 1). Kromatin klipptes av ultraljudsbehandling, Pre-rensas med protein G konjugerade agaros pärlor och inkuberades med anti-p65, anti-c-Rel, eller normal IGG vid 4 C över natten. Efter att protein G tillsattes för 2 h vid 4 c, tvättades komplexet på ett sekventiellt sätt med låg-och högsaltimmunkomplex tvättbuffertar (0. 1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mm EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.1 plus 150 mM NaCl för lågt salt och 500 mM NaCl för höga saltbuffertar) följt av TE-buffert (två gånger). DNA-transkriptionsfaktorinteraktionen reverserades efter tillsats av NaCl och inkubation vid 65 kcal C över natten. Efter RNAs A och Proteinas K digestion renades DNA-fragment genom fenol/kloroform extraktion och etanolutfällning. DNA renades och användes för PCR med primers specifika för genpromotorregionen som omfattar NF-kB-bindningsställen. CD47 primers var:

5′-CGTGGACCAGGACACCTAGG-3′ (sense)

5′-AGGGAAGAGAACCGCATAGG-3′ (antisense)

The PCR amplification of the IκB promoter region (1134/902) was also included as positive. The primers for NF-κB-binding site in the IκB promoter were:

5′-TGTAGCACCCATTAGAAACACTTC-3′ (sense)

5′-TTCTTGTTCACTGACTTCCCAAT-3′ (antisense).

Preparation of anti-human and anti-mouse CD47 antibodies

Hybridoma for monoclonal mouse anti-human CD47 antibody (B6H12.2), IgG2b were obtained from ATCC. Monoklonal råtta anti-mus CD47 IGG2A antikropp (MIAP301) och hybridom erhölls från Dr.William Frazier (Washington University School of Medicine). Båda hybridomcellinjerna bibehölls i IMDM-medium med 20% FBS. Antikroppar renades från hybridom supernatant med användning av protein g-harts från GenScript (katalog # L00209) enligt tillverkningsstandardprocedurer. Prover koncentrerades sedan ytterligare 10-20 gånger med användning av mikrosep centrifugalanordningar från Pall Life Sciences. Koncentrationer av renat IGG bestämdes genom mätning av absorbansen vid OD280.

fagocytosanalys

både humana monocyt thp1-celler och mus m råa 264,7-celler (ATCC, TIB-71) bibehölls i en 5% CO2-inkubator vid 37 kg C66 vid en ungefärlig densitet av 1 kg 106/ml. Om 0,8 106-celler/ml av råa 264,5-celler eller 1 106 106 thp1-celler såddes på en 6-brunnsplatta. Efter 24 h inkubation rå 264,7 celler aktiverades genom behandling med 0,1 occurg/ml lipopolysackarid (LPS) för 24 h. monocyt thp1-celler differentierades med Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) (40 nM) för 48 h. Aktiverade makrofager färgades med Dio vid slutlig samordning 40 nM i ett medium för 20 min följt av sköljning tre gånger med medium. Cancerceller märktes med 1 oc DDAO (5 mM stamlösning i DMSO lagrad vid -20 oc C) i PBS vid 37 oc C under 15 min och tvättades med PBS innehållande 1% FBS. Ddao-märkta målceller (1 msk 106) tillsattes till DIO-färgade m-kakor och inkuberades i en slutlig volym av 2 ml vid 37 C-kakor under 2 timmar. efter inkubationen skördades m-kakor och målceller med tre gånger EDTA-PBS-tvätt följt av 0,25% trypsinisering. Fagocytos bedömdes genom att utvärdera de dubbelmärkta cellerna (DIO+/DDAO+), som representerar fagocytiserade bröstcancerceller av mogna M-celler, via flödescytometri. FlowJo-programvaran användes för analys.

Clonogenic survival assay

Clonogenic survival assay utfördes efter strålning med eller utan behandling (Lapatinib, 10 occurm för 72 h; Anti-CD47 antikropp 10 occurg/ml över natten). De behandlade cellerna odlades i 10-14 dagar och kolonier fixerades, färgades med Coomassie-blå fläck. Kolonier innehållande mer än 50 celler räknades som överlevande kloner och normaliserades till pläteringseffektiviteten hos varje skambehandlad tumörcellinje.

Gap-filling rate assay

Gap-filling kapacitet mättes med 1 106-celler i varje 6-brunnsplattor till 100% sammanflöde följt av 24-timmars cellsvält. Sedan skapades gapet genom att skrapa skålen diagonalt med en steril pipettspets. Cellerna lämnades antingen obehandlade eller behandlades med 10 USC/ml IgG-eller anti-CD47-antikropp under experimentets varaktighet. Fyllningskapaciteten övervakades i 72 timmar och representativa bilder togs på dag 0 (skrapdag) och dag 3.

Tumörsfärbildning

celler siktades med 40 oC-celler (katalog # 352340. Corning) och encelliga suspensioner såddes i lågfäst 60 mm petriskålar med en densitet av 1000 celler/ml. Cellerna odlades i serumfritt Bröst epithelial basal medium (MEBM), kompletterat med B27 (katalog # 17504-044. Life Technology), 20 ng/ml EGF (katalog # 4022-500. Bio-vision), 20 ng/ml grundläggande-FGF (katalog # 13256-029. (Katalog # 80603-686 EMD MILLIPORE). Celler odlades i 10 dagar och tumörsfärer räknades under ljusmikroskopi.

transwell invasion analys

alikvoter (0. 4 ml) av Matrigel (katalog # 356231. BD Biosciences) späddes i beläggningsbuffert: 0,01 m Tris (pH 8,0), 0,7% NaCl till den slutliga koncentrationen av 200-300 oc/ml. Om 100 ubicl laddades in i den övre kammaren av 24-brunns transwell (katalog # 3422. Costar) och inkuberades vid 37 C för gelning ca 1 h. Ta försiktigt bort den återstående beläggningsbufferten från det permeabla stödmembranet utan att störa skiktet och lägg sedan till celler (2,5 104/ml). Den nedre kammaren fylldes med 800 oc mem media innehållande 5 oc / ml fibronektin (katalog # SC-29011. Santa Cruz). Transwellen med olika behandlade celler inkuberades i 48 h och färgades med Diff-Quick Stain kit (katalog # K7128. IMEB INC).

beredning av F (ab’) 2 fragment

CD47 F (ab’) 2 fragment framställdes genom papain harts klyvning av IgG med användning av en F (ab’) 2 beredningssats (katalog # 786272. G-Bioscience) enligt tillverkarens rekommendationer och rapporterade förfaranden67. Efter papain digestion separerades Fab-fragmentet från osmält IgG och Fc-regionen med proteinet a-Spinnkolonn från Fab-Fragmenteringssatsen SpinOUT GT-600 AVSALTNINGSKOLONNERNA levererades för att säkerställa att det initiala antikroppsprovet var det optimala tillståndet för Fab-fragmentering och den renade anti-mus CD47 IGG samlades in för in vivo-mustumörbehandling.

strålning av BC-celler med CRISPR-KO CD47 och / eller HER2

För in vivo-test av tumörinhiberingseffektivitet genom strålning med bristfällig CD47 och HER2-status implanterades 5 105 4t1/C2− celler med CRISPR− knockout av CD47 (CD47−/−), HER2 (HER2−/−) eller dubbel (CD47−/−/HER2 -/ -) i BRÖSTFETTKUDDARNA i BALB/c (n = 6 per grupp). Tumörtillväxt bedömdes genom att mäta tumörvolymen var 2: e dag från och med dag 7 tills tumörvolymerna nådde begränsningen. För att bedöma radiosensitiviteten hos tumörer med olika status CD47 och HER2 levererades lokal tumörstrålning med 5 Gy till varje tumör vid dag 9 och tumörtillväxt mättes varannan dag tills kontrolltumörer nådde maximal begränsning.

RT av mus BC med anti-CD47 och/eller HER2-behandling

För in vivo-test av tumörhämning med en enda CD47-antikropp i närvaro eller frånvaro av strålbehandling följde anti-CD47-behandling protokollet av Willingham et al20 med vissa modifieringar. Åtta veckor gamla immunkompetenta (BALB / c) honmöss (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) injicerades med 1 msk 105 musbröst 4t1-celler i de 4: e bröstkörtlarna. Fifty mikroliter PBS innehållande 100 USCG kontroll IgG eller anti-CD47 F (ab’) fragment injicerades i tumörstället (dag 1) eller i tumörvävnaderna (dag 15) och upprepades varannan dag fram till slutet av experimenten. Tumörvolymer övervakades var 5: e dag. För strålbehandling, anti-CD47 eller strålning i kombination med anti-CD47 delades djuren med 4t1-tumörer slumpmässigt in i olika behandlingsgrupper och en kontrollgrupp (5-10 möss per grupp). Tumör lokal strålning startade när tumörvolymen når 200 mm3 med FIR (5 Gy/dag/tumör för fyra fraktioner med användning av mikrostråle IR-källa; total dos = 20 Gy) kombinerat med tre gånger tumörinjektioner av anti-CD47 F (ab’). Radiosensitiviteten hos de in vivo bestrålade tumörerna med närvaro eller frånvaro av anti-CD47 F (ab’) utvärderades genom mätning av tumörvolym i slutet av experimenten. Djuren euthaniserades när tumörerna var ~1400 mm3 eller när djuren verkade vara obekväma även när tumören var mindre än 1400 mm3 för att följa UCD iacuc-regler för användning av ryggradsdjur i forskning. Djuranvändnings-och vårdprotokollet för in vivo-strålbehandling godkändes av Institutional Animal Use and Care Committee vid University of California Davis (iacuc 15315).

För in vivo-test av tumörinhibering med dubbla antikroppar mot CD47 och HER2 i närvaro eller frånvaro av strålbehandling injicerades åtta veckor gamla immunkompetenta (BALB/c) kvinnliga möss (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) med 1 msk 105 musbröst 4t1-celler i de 4: e bröstkörtlarna. När tumörvolymerna nådde cirka 200 mm3 delades möss slumpmässigt in i fyra grupper (6 möss per grupp). PBS, IGG, Anti-CD47 f (ab’) fragment (100 UKG) eller Herceptin (5 mg/kg) injicerades i tumörvävnader 4 timmar före lokal strålbehandling (5 Gy per dag i 2 dagar). Injektioner utfördes och tumörstorlekar övervakades varannan dag till slutet av experimenten. Möss euthaniserades när tumörerna var ~1400 mm3 eller när djuren verkade vara obekväma även när tumören var mindre än 1400 mm3 för att följa UCD iacuc-regler för användning av ryggradsdjur i forskning. Djuranvändnings-och vårdprotokollet för in vivo-strålbehandling godkändes av Institutional Animal Use and Care Committee vid University of California Davis (iacuc 15315).

Tumörinfiltrerade makrofager och makrofagfagocytos

GFP-Uttryckande musbröstcancer 4t1-celler implanterades i 4: e bröstfettkuddar av BALB/c-Möss och behandlingen startades när tumörer uppnådde cirka 200 mm3 genom tumörinjektion av 50 kg PBS innehållande 100 kg kontroll IgG, Anti-CD47 F (ab’) fragment, Herceptin eller båda antikropparna varannan dag i tre gånger. Tumör lokal RT levererades på dag 10 och 11 med 5 Gy/dag/tumör för två fraktioner, total dos = 10 Gy och experiment avslutades 2 dagar efter avslutad antikroppsbehandlingar. Tumörer extraherades och FFPE-sektioner bereddes för immunofluorescensfärgning för att följa standardproceduren: glidbanorna deparaffiniserades och rehydratiserades och antigener hämtades i 40 minuter i en citratbuffert (pH 6.1) vid 95 kcal C. För att avlägsna autofluorescens sockades glidbanorna i de-autofluorescenslösning (0.5 m CuSO4, 0.05 M NH4COOH i H2O) vid RT i 48 timmar, sköljdes med vatten 5 min 3times och blockerades sedan med 1:100 hästserum. Den primära antikroppsinkubationen gjordes vid 4 kg C över natten: anti-GFP (1:100; Dako), Anti-CD11b (1:100; Millipore); Efter tvättning inkuberades glidbanor med 1: 250 utspädda fluorescerande konjugerade sekundära antikroppar (Rhodamin för CD11b, Alexa Fluor 488 för GFP) vid RT i 1 h och monterades sedan med Vectashield Antifade-lösning innehållande DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Makrofagmedierad fagocytos detekterades med fluorescerande mikroskopi med Axiovision-programvara (Zeiss, Tyskland) och mikrofotografer kvantifierades av ImageJ.

statistisk analys

alla experimentella data som erhållits från in vitro-cellulära studier och djurförsök presenteras som medelvärde av 2-tailed Student t-test för två grupper eller ANOVA för flera grupper. Den statistiska signifikansen av Kaplan-Meier överlevnadskurvor bedömdes med ett Mann–Whitney-test. Antalet oberoende experiment och replikaten indikerades i figurlegenderna. P-värden < 0,05 ansågs vara signifikanta och indikeras med asterisker enligt följande: *P < 0.05, * * P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

rapportsammanfattning

Mer information om forskningsdesign finns i Nature Research Reporting Summary som är länkad till denna artikel.