Encefalitozoon Cuniculi stam III är en orsak till Encefalitozoonos hos både människor och hundar

Abstrakt

Mikrosporidier är obligatoriska intracellulära eukaryota organismer som finns i ett brett spektrum av ryggradsdjur och ryggradslösa värdar. Encephalitozoon cuniculi finns ofta hos tamkaniner och gnagare och förekommer också hos hundar, andra hundar och primater, inklusive människor. DNA-sekvensering av de ribosomala RNA-generna har använts för att identifiera dessa parasiter till en artnivå och för att definiera E. cuniculi-stammarna i, II och III. åtta nya hundisolat karakteriserades som E. cuniculi-stammen III genom användning av molekylära metoder. Denna stam har också identifierats i isolat från immunkomprometterade människor, vilket tyder på den zoonotiska potentialen hos denna parasitart. Långvarig microsporidial spore shedding från asymptomatiska hundar rapporteras också.

Encephalitozoon cuniculi är en obligatorisk intracellulär protozoan av phylum Microsporaen och är en vanlig parasit av tamkaniner och gnagare. Ibland har dessa parasiter rapporterats hos andra värdar, inklusive hundar, blårävar (Alopex lagopus) och ett litet antal andra vilda köttätare . Allt fler rapporter beskriver också klinisk sjukdom hos människor orsakad av E. cuniculi, men källan till mänsklig infektion är okänd .

historiskt var parasitidentitet baserad på morfologiska och ibland ultrastrukturella egenskaper. Nyligen har morfologiskt liknande medlemmar av Encephalitozoon-släktet specierats genom användning av immunologiska egenskaper och molekylär karakterisering av ribosomala RNA-gener . Isolat av E. cuniculi har vidare delats upp som stammar i, II eller III, baserat på antalet upprepningar av en 4-bassekvens (5′-GTTT-3′) i den inre transkriberade distansregionen (ITS) i den ribosomala RNA-genen . Två hund E. cuniculi isolat betecknades stam III på grundval av närvaron av 4 sekvensrepetitioner . Därefter identifierades humana isolat av 4 människor som stam III (isolat” Donovan ” GenBank X98466, CDC: V282 och IPZ: MX-H5) och som stam I i två rapporter från Europa . Denna studie utvidgar det arbetet genom att identifiera 8 ytterligare hundisolat av E. cuniculi från 4 utbrott som stam III. även om inga epidemiologiska data direkt har bekräftat hund-till-mänsklig överföring, föreslår molekylära data att hundar kan fungera som potentiella reservoarer av parasiter. Dessutom har långvarig spridning av sporer av asymptomatiska hundar dokumenterats, vilket ytterligare förstärker sannolikheten för zoonotisk överföring av parasiten.

material och metoder

Parasitisolat

kropparna på 7 valpar från 3 orelaterade kullar och 1 hund skickades över 18 månader till Texas Veterinary Diagnostic Laboratory för utvärdering efter döden. Djuren var från fyra orelaterade källor från olika regioner i Texas. En diagnos av encefalitozoonos ställdes i varje fall på grundval av histologiska fynd. Åtta parasitisolat etablerades från färska vävnader hos djuren: 5 isolat härleddes från hjärn – eller njurvävnader från 5-till 7 veckor gamla Boston terrier valpkullkamrater (2 män, 3 kvinnor) som dog av neurologisk sjukdom (isolat 1-5, kull 1). Isolat 6 härstammar från hjärnan hos en 10 veckor gammal maltesisk terrier som var 1 av 4 kullkamrater (kull 2) som dog av neurologisk sjukdom. Isolat 7 härleddes från hjärnan hos en 10 veckor gammal kvinnlig miniatyrpudelvalp (kull 3) som dog av neurologisk sjukdom. Isolat 8 härleddes från njuren av en 18 månader gammal kvinnlig miniatyrtax som dog av njursvikt (tabell 1).

vid postmortem samlades vävnader aseptiskt och homogeniserades (Ten Broeck tissue homogenizer; Corning, Corning, NY) med användning av PBS, pH 7.2, plus 2 msk antibiotikum-antimykotisk lösning (Gibco, Gaithersburg, MD). Mikrosporidiala sporer renades från värdvävnadshomogenat med användning av en tidigare beskriven gradientmetod för perkolldensitet modifierad genom att ändra centrifugeringshastigheten till 600 g . Mikrosporidierna odlades i rk-13-celler (ATCC CCL-37) Med användning av RPMI 1640-medium kompletterat med 5% fetalt bovint serum och 2 msk antibiotikum-antimykotisk lösning (Gibco) som tidigare beskrivits . Parasitkultur och DNA-analys gjordes under flera månader baserat på mottagandet av de olika fallproverna, så möjligheten till oavsiktlig korskontaminering var försumbar.

DNA-isolering

för isolaten 1-6 och 8 odlades parasiter i kortvarig kultur för att generera adekvata sporer för molekylär karakterisering. För isolat 7 renades parasiter direkt från färsk valphjärnvävnad för DNA-isolering. För de flesta isolaten extraherades DNA från renade sporer med användning av Instagenmatris (BioRad, Hercules, CA), enligt tillverkarens protokoll för bakteriekulturer . För en del av det molekylära arbetet med isolaten 6 och 8 bearbetades sporer som tidigare beskrivits och DNA extraherades från sporer med en standard fenolkloroform extraktionsmetod med användning av ett partitioneringsgelmikrofugrörsystem (ljusfaslåsgelsystem; 5 Prime 2 Prime Manufacturer, Westchester , PA) för att optimera DNA-återhämtning. DNA utfälldes etanol, pelleten omsuspenderades i TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.6) och DNA-koncentrationen uppskattades med användning av a260 : A280-förhållanden med UV-spektrofotometri (Ultraspec Plus; Pharmacia, Piscataway, NJ). DNA extraherat från vävnadskultur—härledda sporer av Encephalitozoon hellem användes som en positiv kontroll, och en reagens-endast negativ kontroll inkluderades i alla extraktions-och sekvenseringsreaktioner.

DNA-partiell sekvensering och analys av den lilla subenheten ribosomalt DNA (SSU rRNA) – genen

en del av 5′ – änden av SSU rRNA-genen från vart och ett av de 8 isolaten förstärktes med användning av primerpar PMP1 och PMP2, som tidigare beskrivits . Polymeraskedjereaktionen (PCR)-reaktionen för varje isolat utfördes enligt tillverkarens instruktioner (GeneAmp PCR-kärnreagenser, N808-0009; Perkin-Elmer Cetus/Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). Förstärkningen gjordes i en termisk Cyklare (PTC-200 Peltier; MJ Research, Watertown, MA). Efter initial denaturering i 5 minuter vid 95 CCG tillsattes Taq-polymeras (0,5 U) till varje 25-oC-reaktion. Proverna genomgick sedan 35 cykler av denaturering (94 CCB, 30 s), glödgning (60 CCB, 30 s) och förlängning (72 CCB, 1 min) följt av 10 min vid 72 CCB för slutlig förlängning. Oinkorporerade nukleotider avlägsnades med användning av kromatografikolumner (Micro Bio-Spin 30; BioRad). Proverna hölls vid 4 2BG C tills de bearbetades för automatiserad sekvensering.

DNA-analys av ITS-regionen

en del av ITS-regionen av den ribosomala RNA-genen för varje isolat förstärktes med PCR med int530f-och int580r-primerparet med användning av de ovan beskrivna amplifieringsmetoderna. Den resulterande PCR-produkten sekvenserades i en automatiserad DNA-sekvenserare (modell 377; Perkin-Elmer Applied Biosystems/Roche Molecular Systems, Branchburg).

DNA-automatiserad sekvensering

PCR-förstärkt DNA för varje isolat förstärktes för automatiserad sekvens med ett kommersiellt kit (ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready-Reaction Kit; Promega, Madison, WI) följer tillverkarens instruktioner. Alla reaktioner kördes i en termocykler (MJ Research Minicycler). Proverna genomgick sedan 35 cykler av denaturering (94 CCB, 30 s), glödgning (60 CCB, 30 s) och förlängning (72 CCB, 1 min) följt av 10 min vid 72 CCB för slutlig förlängning. Förlängningsprodukter renades med användning av kromatografikolumner (Micro Bio-Spin; BioRad), torkades i en vakuumcentrifug (Savant Instruments, Holbrook, NY) och lagrades vid -20 c c tills de sekvenserades i en automatiserad sequencer (Perkin-Elmer 377 Abi Applied Biosystems).

genom användning av justeringsprogramvara (Sequencher; Genkoder, Ann Arbor, MI) erhölls konsensussekvenser av 265 baser för en del av SSU rRNA-genen för varje parasitisolat. Dessa sekvenser utvärderades för homologi mot tidigare rapporterade Encephalitozoon-sekvenser i NCBI GenBank-databasen med en enkel BLASTN-sökning.

dubbelsträngat DNA heteroduplex mobilitetsanalys

DNA från isolat 6 förstärktes med PCR med primerparet int530f och int580r som tidigare beskrivits . De PCR-förstärkta produkterna analyserades för generering av heteroduplexer och homoduplexer med användning av tidigare karakteriserade isolat av E. cuniculi från olika värdar.

resultat

totalt 8 parasitisolat från 4 separata kliniska utbrott fastställdes i vävnadsodling. Både lätta mikroskopiska egenskaper och in vitro-tillväxtegenskaper hos parasiterna föreslog att de var E. cuniculi, en mikrosporidian som tidigare rapporterats hos hundar såväl som andra värdar. Partiell sekvensering av 5′ – änden av varje isolats SSU rRNA-gen (GenBank AF144246-AF144253) bekräftade parasiternas identitet som E. cuniculi, eftersom alla exemplar visade 100% homologi med tidigare publicerade sekvenser (GenBank L39107dEZORGOA, L17072¦EZORGSMALL; X98470¦ECDSSRR2).Heteroduplex-analys och sekvensering av its-regionen av den ribosomala RNA-genen karakteriserade vidare alla hundisolat som stam III, vilket bekräftade tidigare rapporter om subtila variationer bland E. cuniculi-isolat från olika gnagare, kanin och mänskliga värdar. Figur 1 illustrerar DNA-homoduplexbildning mellan hundisolat 6 och ett tidigare karakteriserat stam III-isolat samt heteroduplexbildning mellan isolat 6 och de andra E. cuniculi-stammarna.

diskussion

den biologiska betydelsen av flera stammar av E. cuniculi har ännu inte klargjorts; förmågan att skilja mellan parasitstammar kan dock ge ett verktyg för att spåra infektionskällor i epidemiologiska studier. Våra molekylära data som identifierar 8 mikrosporidianisolat från hundar som E. cuniculi stam III överensstämmer med en tidigare studie som klassificerade 2 hundisolat som stam III . Isolat av kanin, mus och räv har rapporterats som stammar i eller II . Dessa data tyder på att Stam III huvudsakligen kan förknippas med hundar. Mänskliga isolat har identifierats som stam III på västra halvklotet och som stam I i Europa . Även om källan(erna) för mänsklig exponering för E. cuniculi är okänt, det finns ökande bevis för att djur kan fungera som infektionsreservoarer, och det finns en möjlighet till zoonotisk överföring av organismen mellan djur och människor. Det är en intressant möjlighet att geografiska och kulturella skillnader i husdjursägande kan spela en roll i människors exponering, eftersom hundar är vanliga husdjur i USA, medan kaniner ofta hålls som husdjur eller som mat i Schweiz och andra europeiska länder.

undersökning av fekala och urinprover från de kliniskt normala Boston terrier-föräldrarna och 1 valp från kull 1 visade låga nivåer av sporeavfall för 6 månader efter kullkamraternas död (isolat 1-5; opublicerade data). Denna observation föreslår vidare en möjlig mekanism för direkt eller indirekt överföring av parasiterna från hundar till människor genom förorening av lokaliserade miljöer med hund urin och fekal utsöndring. Även om ingen epidemiologisk studie har utvärderat förhållandet mellan husdjursägande/exponering och humana mikrosporidiala infektioner, i ett enda fall där barn utsattes för valpar med öppen encefalitozoonos, 1 av 3 barn serokonverterade . Ytterligare E. cuniculi-isolat från olika värdar måste analyseras för att ytterligare utvärdera risken för att bibehålla potentiellt infekterade husdjur i hushållen hos immunkomprometterade personer med hög risk för mikrosporidiala infektioner.

bekräftelser

Vi tackar Texas Veterinary Medical Diagnostic Laboratory patologer Jay Hoffman, Joanne Mansell och Bruce Abbitt för att tillhandahålla hundvävnader för denna studie.