experimentell och terapeutisk medicin

introduktion

bronkialastma är en kronisk inflammatorisk luftvägsjukdom som involverar många inflammatoriska celler och mediatorer. T-celler, särskilt T helper (Th)1 och Th2. har en avgörande roll iinduktion av luftvägsinflammation hos astmatiska patienter (1). Komplicerade immunsvar är kapablaav inducerande Th1-brist och Th2-hyperaktivitet, vilket resulterar i en Th1/Th2-obalans. Denna obalans främjar immunoglobulin (Ig)Esekretion och sensibiliserar mastocyt och eosinofiler via förändradcytokinsekretion och orsakar allergisk inflammation ochhyper-responsiveness av luftvägarna (2,3).Interferon (IFN) – Aci och interleukin (IL) -4 är typiska cytokiner avth1 respektive Th2.

hos patienter med astma initieras persistent luftvägsinflammation av antigenpresenterande celler (APC), somintegrera olika allergener i en signal för T-celler och prime de efterföljande immunsvar (4,5).Aktivering av T-celler kräver signaler som initieras via theTCR-komplex och kluster av differentiering (CD)28. Mogna dendriticcells (mDCs) uttrycker höga nivåer av de co-stimulerande molekylercd80 och CD86, som ger den signal som krävs fortriggering T-cellaktivering, expansion och differentiering viainteraction med CD28 (6). Tidigare studier har visat att CD80-och CD86-nivåer är förhöjda inpatienter med astma (7,8).

i tidigare studier som undersökte astmatiska modeller har MDC: er visat sig inducera Th2-polarisering, uppreglera IL-4-sekretion, nedreglera IFN-hawaiiproduktion och inducera eosinofil inflammation (9,10). Studier som undersöker effekterna av knockdown av CD80 och CD86 i DCs pådifferentiering av och cytokinsekretion av T-hjälparceller imurinmodeller av astma saknas emellertid.

i den aktuella studien blockerades samstimulerande t-cellaktiveringssignaler genom undertryckande av CD80 – och CD86-Molekyluttryck på DCs med användning av litet störande RNA( siRNA), ochEffekterna av cd80-och CD86-knockdown på uttrycksnivåerna av Th1/Th2 typiska cytokiner IFN-Kazaki och IL-4 utvärderades. Således undersöktes potentialen för CD80 och CD86 som mål för tillämpningen avrna-interferens (RNAi) vid terapeutisk inriktning av astma.

material och metoder

djur

totalt 20 friska specifika patogenfria gradebalb / c-möss (6-8 veckor; medelvikt, 18 2 g oc) köptes fråncentrum för försöksdjur av Sun Yat – Sen University (Guangzhou, Kina). Experiment utfördes enligtprotokoll godkända av Animal Studies Committee of Sun Yat-SenUniversity.

Astmamodeller

totalt 20 möss tilldelades slumpmässigt till tvågrupper: i) den astmatiska gruppen och ii) den normala kontrollen group.In den astmatiska gruppen var varje mus sensibiliserad för ovalbumin (ägg; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) intraperitonealt på dagar1, 14 och 21 med 100 occurg ägg som emulgerades i 20 mg alun(Guangzhou Chemical Reagent Co., Guangzhou, Kina). Därefter exponerades mössen för en aerosolutmaning på 5% ägg i 30 minuter / dag i lufttäta behållare (med dimensioner på 50 50 50 50 cm) på dagar 28-34. I den normala kontrollgruppen sensibiliserades Möss och utmanades som ovan med en ekvivalent mängd saltlösningi stället för ÄGGPROTEINLÖSNINGEN. Vid 24 h efter det sistautmaning, möss offrades av en godkänd cervikal dislokationprocedur utförd av skicklig och fullt utbildad personal. Thelungs avlägsnades och fixerades sedan i 10% etanol under 24 timmar.prover dehydratiserades, inbäddades i paraffin och färgades medhematoxylin och eosin som tidigare beskrivits (11). Patologiska förändringar i bronkial ochlungvävnader bedömdes under ett Nikon Eclipse Ti-ljusmikroskop (Nikon Corporation, Tokyo, Japan).

Separation av benmärgsderivatdcs

alla möss offrades av cervikal dislokation 24 timmar efter den sista utmaningen. Benmärgen spolades från thefemurs och tibiae med rpmi-1640 odlingsmedium (Gibco; ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Followingcentrifugation vid 250 kg i 5 minuter behandlades celler med lysbuffert för rödblodceller (RBC) (CWBio Co., Ltd., Peking,Kina), tvättad med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), centrifugerad vid 250 kcal gfor 5 min och odlad i RPMI-1640 kompletterad med rekombinantmus granulocytmakrofagkolonistimulerande faktor (rmGM-CSF;Peprotech, Inc., Rocky Hill, NJ, USA; 10 ng/ml) och rmIL-4(Peprotech; 10 ng/ml) användes i sin tur. Efter 6 dagar av kultur tillsattes 1 kg/ml lipopolysackarid (LPS; Sigma-Aldrich), och sedanicke-vidhäftande MDC skördades på dag 7. DC: er färgades vid 4 kg Cfor 30 min med fluoresceinisotiocyanat (FITC)-konjugerad hamster anti-CD11c (5 kg/ml; 11-0114), phycoerythrin (PE)-konjugerad hamster anti-CD80 (5 kg/ml; 12-0801), FITC-konjugerad anti-CD86 (5 kg/ml; 11-0862) och PE-konjugerad råtta anti-CD majorhistokompatibilitetskomplex (MHC) II (5 kg/ml; 12-5322; allebioscience, Inc., San Diego, CA, USA) monoklonala antikroppar och analyserades därefter med flödescytometri (BD FACSVerse; BDBiosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) för att bestämmapositiv uttryckshastighet för det märkta antigenuttrycket.

siRNA och transfektion

de specifika siRNA-sekvenserna(tabell i) som riktar sig till CD80 och CD86 utformades och valdes enligt metoderna för Gu et al (12). Alla siRNA köptes frånshanghai GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, Kina). Transfektionssteget utfördes enligt tillverkarens protokoll forLipofectamine 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.).Kortfattat odlades DC: er i en 24-brunns vävnadsodlingsplatta vid endensitet av 1 105 celler/brunn på dagen före transfektion. Tillförbereda lipid-siRNA-komplex, 3 kg Lipofektamin 2000 inkuberades i 50 kg Opti-MEM (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) vid rumstemperatur i 5 minuter och 12 occl av den angivna siRNA varför närvarande kombinerad med 50 occl Opti-MEM. Den utspädda lipofektamin 2000 och siRNA blandades därefter och inkuberades ytterligare 20 minuter vid rumstemperatur för komplex bildning.Därefter inkuberades komplexet med DCs i en 24-brunnsplatta vid 37 kcal C i en 5% fuktad CO2 i luftatmosfärför 6 h. när kotransfektion utfördes tillsattes ekvivalenta mängder avcd80 siRNA:Lipofektamin 2000 och CD86 siRNA:Lipofektamin 2000komplex till varje brunn. FAM-scrambled-siRNA användes somDen negativa kontrollen för att bestämma transfektionseffektiviteten. Tre grupper av transfekterade DC: er etablerades: i den icke-siRNA-gruppen tillsattes endast Lipofektamin 2000, utan att anysiRNA tillsattes till DCs. I siRNA-gruppen var MDC: ertransfekterade av CD80 – och CD86-specifika siRNA. I negativesiRNA-gruppen transfekterades MDC: er av icke-specifik icke-targetingFAM-siRNA, som inte har någon homologi med de riktade rna: erna.Experiment utfördes i tre exemplar för varje prov.Transfektionseffektivitet bestämdes med användning av fluorescensmikroskopi (Nikon Eclipse Ti, Nikon Corporation) och detekterades avflödescytometri.

omvänd transkription-kvantitativpolymeraskedjereaktion (RT-qPCR)

för att utvärdera CD80-och CD86-mRNA-uttrycksnivåerföljande transfektion utfördes RT-qPCR. Primersekvenser (tabell II) designades enligt GenBank och syntetiserades av DaAn Gene Co., Ltd. av Sun Yat-SenUniversity (Guangzhou, Kina). Vid 24 timmar efter transfektion extraherades totalRNA på 1 106 xnumx xnumx xnumx DCs med användning av Trizolreagens (Invitrogen;Thermo Fisher Scientific, Inc. används QuantiTect SYBR Green RT-PCR kit (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland) i en Roche LightCycler 480 (Roche Diagnostics,Basel, Schweiz). Förstärkningarna utfördes enligt tillverkarens protokoll för QuantiTect SYBR Green RT-PCRkit (Takala, Japan). Förstärkningsbetingelser var 40 cykler av93 CCB för 3 min, 93 CCB för 30 sek, 55 CCB för 45 SEK och 72 CCB för 45 sek. varje prov administrerades till var och en av tre brunnar. Relativegene expression levels were calculated using the quantificationcycle (Cq) method with normalization to glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) as the reference gene using 2−∆∆Cq(13).

flödescytometri

för att detektera de positiva uttryckshastigheterna för CD80 och CD86 på DCs efter transfektion utfördes flödescytometri på MHC II/CD11c-porten för CD80 och CD86. Sex timmar efter transfektion, DCs tvättades två gånger med PBS och inkuberades med fluorescerande märkt antikropp vid 4 C i 30 min.Därefter tvättades cellerna igen med PBS och fixerades med10 g/l paraformaldehyd. Följande monoklonala Anti-musantikroppar användes: PE-anti-MHC II, FITC-Anti-CD11c, PE-Anti-CD80 och FITC-Anti-CD86, som nämnts ovan. Alla flödescytometriska analyser utfördes med användning av IGG-isotypiska kontroller.

t-cellseparation

mjälten avlägsnades efter att mössen hade blivit euthaniserad genom cervikal dislokation. T-celler separerades med användning avmuslymfocytseparationsmedium enligt tillverkarens protokoll (Dakewe Biotech Co., Ltd., Kina). Celltätheten varjusteras till 1 109/l 109 / L före vidare bearbetning.

blandad lymfocytreaktion(MLR)

den astmatiska Murin benmärgs-härledda DCs (1 kg 104/brunn) och friska T-celler (1 kg 105/brunn) odlades i96-brunnsplattor i ett förhållande 1:10. Samkultursystemen delades in i tre grupper: i) den icke-siRNA-gruppen, ii) siRNA-gruppen, andiii) den negativa siRNA-gruppen, med DCs från motsvarande grupper som beskrivits ovan. Därefter tillsattes ägg till varje brunn till enfinal koncentration av 10 mg/l i en total volym av 200 occyl. Cellerna inkuberades vid 37 CCB i en 5% fuktad CO2 i luftatmosfär under 72 timmar.

Enzymbundna immunosorbentanalyser (ELISAs)

Efter 3 dagars samodling samlades supernatanten. Nivåerna IFN-och Il-4 analyserades med hjälp av ELISA-kitsspecific för IFN-och Il-4 (Dakewe Biotech Co., Ltd.) enligt tillverkarens instruktioner. Absorbansvärden lästes vid 450 Nm med användning av en Multiskan MK3 (Thermo Fisher Scientific, Inc.).

statistisk analys

statistiska analyser utfördes med SPSSsoftware, version 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Data presenteras som den genomsnittliga standardavvikelsen för standardavvikelsen för Taiwan (SD). Undersökningar varutförs i tre exemplar för varje mus. Statistiska jämförelsermellan grupper utfördes med hjälp av envägsanalys av varians, och jämförelser inom en grupp utfördes med hjälp av Student ’ St-test. Skillnader mellan grupper ansågs statistisktbetydande när P<0,05.

resultat

astmatisk modell

de 20 friska SPF-Grade BALB/c-mössen tilldelades astmatiska och normala kontrollgrupper, med 10 möss i vardera. Allmice utvärderades i slutändan utan experimentelldjurförlust. Enligt lungvävnadspatologin, lungavsnittfrån de ÄGGIMMUNISERADE mössen visade tydlig luftvägsinflammation medperibronchiolära och perivaskulära infiltrat. Dessa infiltrerbestod huvudsakligen av eosinofiler och lymfocyter, ochsektioner visade bronkial slemhinna och glattmuskelförtjockning,ökad slemsekretion, epitelceller i luftvägarna, luftvägstenos och inflammatoriska celler spridda i lunginterstitium. Inga signifikanta patologiska förändringar observerades ilungavsnitt från den normala kontrollgruppen. Representanthistopatologiska data visas i Fig.1.

Cellytemolekyluttryck bymDCs

uttrycksnivåerna för CD11c, CD80 och CD86 på themDC-ytor detekterades genom fluorescensaktiverad cellsortering(FACS). mDCs från den astmatiska gruppen uttryckte CD11c på en nivåjämförbar med den i den normala kontrollgruppen; ingen signifikant skillnad hittades mellan de två grupperna (P>0,05). Men i jämförelse med den normala kontrollgruppen, den astmatiska gruppenvisade signifikant högre CD80-och CD86-uttrycksnivåer(P<0,05; Fig. 2).

transfektion av mDCs

de CD80 – och CD86-specifika siRNA-konstruktionerna överfördes framgångsrikt till mDCs. De transfekterade MDC: erna observerades under ett fluorescensmikroskop 6 h efter transfektion.Transfektionseffektiviteten hos siRNA detekterad av FACS var ~75% (Fig. 3).

mRNA och proteinuttryck av Cd80 och CD86 av MDC efter transfektion

mRNA-och proteinuttrycksnivåerna för CD80 ochcd86 i de transfekterade MDC: erna detekterades genom RT-qPCR och Facsanalys vid 24 respektive 72 h efter transfektion. Den CD80and CD86 mRNA nivåer som upptäckts av RT-qPCR anges thatCD80 mRNA nivåer i den icke-siRNA, siRNA och negativesiRNA grupper var 2.09±0.46, 0.60±0.17, och 2.04±0.93 respektive och CD86 mRNA-nivåer var 3.58±0.20,på 0,91±0,48 kr, och 2.83±0.83, respektive. De uppgifter som tillhandahålls av FACSindicated att CD80-protein positiva uttryck priser i thenon-siRNA, siRNA och negativa siRNA grupper var 82.45±15.80,30.79±7.07 och 81.83±10.07%, respektive, och CD86 proteinpositive uttryck priser var 89.45±10.22, 27.29±6.99, and87.66±11.74%, respektive. MRNA-uttrycksnivån och proteinpositiva uttryckshastigheter uppvisade jämförbara resultat. Det fanns ingen signifikant betydelse mellan den icke-siRNA-gruppen och dennegativa siRNA-gruppen (P>0.05). CD80-och CD86-uttryck vid themRNA – och proteinnivåer i siRNA-gruppen minskade signifikant jämfört med det i de icke-siRNA-och negativa siRNA-grupperna(P<0.05; Fig. 4 och 5). Detta visar att siRNA-riktade störningar kan undertrycka CD80-och CD86-mRNA-och proteinuttrycksnivåer avsevärt.

IFN-och Il-4-sekretion av T-celler som odlats med mDCs

efter 72 timmars samodling detekterades IFN-och Il-4-nivåerna i supernatanten av mDC-och T-cells samkultursystem med ELISA. IFN-oc-uttrycket ökades signifikant i siRNA-gruppen (132,73 oc/25,04 pg/ml), jämfört med then-siRNA-och negativa siRNA-grupper (72,56 oc/26,30 respektive 80,21 oc/24,42 pg / ml; P<0,05), medan inga signifikanta skillnader detekterades mellan de icke-siRNA-och negativa siRNA-grupperna(P>0,05). IL-4-uttrycksnivåerna minskade signifikant i siRNA-gruppen (93,04 23,13 pg/ml) jämfört med de icke-siRNA-och negativa siRNA-grupperna (150,69 29,50 och 163,19 25,36 pg/ml, P<0,05), medan inga signifikanta skillnader upptäcktes mellan de icke-siRNA-och negativa siRNA-grupperna(p>0,05; fig. 6).

diskussion

bronkialastma är en kronisk inflammatorisk luftvägsjukdom som involverar en mängd inflammatoriska celler, inklusive mastceller, eosinofiler, lymfocyter och andra cellkomponenter (14-17).Th1 / Th2 obalans är en nyckelfaktor som bidrar till astma svårighetsgrad (18). APC, inklusive DCs, makrofager och B-celler (19), spelar en avgörande roll vid stimulering av T-celler (3). Bland dem är DC den mest kraftfullaapc, som bidrar till primära och sekundära immunsvar,inklusive allergisk immunitet. Mogna DCs (mDCs) med höga nivåer avuttryck av de samstimulerande molekylerna CD80 och CD86 kanaktivera T-celler, medan omogna dendritiska celler (IDC) med låg uttrycksnivå för CD80 och CD86 undertrycker t-cellresponsenoch inducerar immuntolerans (20,21). DCsin-patienter med astma har visat sig vara hyperaktiva (22).

CD80 och CD86 är två typer av protein som uttrycks på APC-ytan och som arbetar i tandem för att tillhandahålla ekostimulerande signaler som är nödvändiga för T-cellaktivering och överlevnad. Tidigare studier har visat att uttrycksnivåerna för de samstimulerande molekylerna CD80 och CD86 på mDC-ytan är nära associerade med Th2-cellreaktion och luftvägsinflammation(23,24). Hos astmatiska patienter kan MDC: er somhögt uttrycker CD80 och CD86 stimulera na acusci CD4+-hjälparens T-cellaktivering för att differentiera mot Th2-celler,vilket resulterar i en Th1/Th2-obalans. Därefter orsakar den otillräckligautsöndring av Th1-cytokiner, såsom IFN-GHz, tillsammans med den ökadeutsöndring av Th2-cytokiner, såsom IL-4 och IL-5, seosinofil inflammation och allergisk luftvägsinflammation(10,24,25). Tvåsignaler krävs för att främja Th2-cellaktivering(26-28). Den första signalen är bildandet av antigen-MHC-komplex på mDC-ytan som binder specifiktmed t-cellreceptorn-CD3-receptorkomplexet på t-cellytor,och den andra signalen är samstimulerande molekyluttryck och funktionell aktivering på mDC-ytorna som specifikt binder tillreceptorer på Na-T-Celler; de två signalerna bildar en samstimulerande väg (29). Det har också föreslagits att det finns en tredje signal (30), eftersom vissa cellulära molekyler som producerasav DCs, såsom tymisk stromal lymfopoietin (TSLP), påverkar riktningen för th-celldifferentiering. Men bland alla deförnämnda signalerna är CD80 / CD86-CD28 co-stimulatory pathway den mest klassiska och viktiga. Tidigare forskning har indikeratatt CD80 / CD86-CD28 samstimulerande väg kan vara en effektivmål för astmabehandling genom att visa att blockeringcd80 / CD86 samstimulerande väg genom monoklonala antikroppsmetoderkan hämma inflammation hos astmatiska möss (25). Dessutom kan undertryckande av CD80 / CD86co-stimulerande väg med användning av antisensoligonukleotider undertrycka luftvägshyperaktivitet (31).

RNAi är ett gendämpande fenomen därbyendogena eller exogena specifika dubbelsträngade rna utlöser nedbrytningen av homologt mRNA och inducerar förlusten av motsvarande funktionella fenotyper. Sedan tekniken först upptäcktes 1998 av Fire et al (32) har tekniken genomgått ytterligare utveckling för att uppnå en hög grad av specificitet och effektivitet. Den terapeutiska tillämpningen av RNAitechnology är ett ämne som har lockat höga nivåer av intresse för grundläggande medicinsk och klinisk forskning de senaste åren.RNAi: s förmåga att hämma virulent genuttryck har ofta använts för att behandla en mängd olika sjukdomar (33-35).Dessutom har ett antal studier rapporterat att RNAi kan användas inDCs för att diagnostisera och behandla bronkialastma (36-39).Darcan-Nicolaisen et al (40)upptäckte att de två stora tecknen på allergisk astma i theOVA-inducerad astmamusmodell, som är luftvägsinflammation ochhyperaktivitet, förbättrades signifikant genom signalomvandlare och aktivator av transkription 6 (STAT6) som tystade i luftvägsepitelceller med användning av administrering av siRNA näsdroppar.Moriwaki et al(41)visade att siRNA-medierad suppressor av cytokinsignalering 3 (SOCS3) gentystning kunde undertrycka luftvägsreaktiviteten andeosinofil infiltration som inducerades av allergenicstimulering hos astmatiska möss. Zheng et al (42) fann att appliceringen av siRNA varkunna hämma tyrosinproteinkinas (TPK) genuttryck i DCs av astmatiska möss, förtrycka den funktionella förmågan hos DCS som antigenpresenterande celler och därigenom hämma T-cellaktivering och differentiering. Studier om effekterna av siRNA-medierad cd80 och CD86 knockdown i DCs på T-celldifferentiering hos astmatiska möss saknas emellertid. I den nuvarande studien minskade CD80 och CD86 mRNA och proteinuttryck i murina bonemarrow-härledda DCs framgångsrikt med CD80 – ochcd86-inriktning siRNA, vilket verifierade effektiviteten hos RNAi.

i den aktuella studien användes en astmatisk musmodell som fastställdes enligt tidigare rapporterade metoder (43). Resultaten indikerade att MDC: er erhållna från den astmatiska gruppen uppvisade ökade Cd80-och CD86-uttrycksnivåer, vilket innebär att CD80/CD86-kapaciteten kan ökas hos astmatiska patienter. Eftertransfektion av MDC: erna med CD80 – och CD86-riktade siRNA minskade themRNA-uttrycksnivåer och proteinpositiva uttryckshastigheter förcd80 och CD86 signifikant, vilket bekräftade den inhiberande effekt som siRNA-metoden hade på Co-stimulatorymolecules CD80 och CD86 vid transkriptionella och translationala nivåer. I supernatanten från samkulturen av MDC: er och T-celler inducerade RNAi en ökning av IFN-excepiliuttryck och en reduktion avil-4-nivåer,vilket indikerar att minskning av uttrycket av ekostimulerande molekyler CD80 och CD86 i MDC försvagade cd80/CD86-CD28 samstimulerande väg hos astmatiska möss. RNAi ocksåpåverkade uttrycket av Th1 / Th2-cytokiner, vilket indikerar att denoriginal Th1 / Th2 obalans ändrades och följaktligen inducerades immuntolerans. Dessa fynd indikerar att CD80 och Cd86kan vara potentiella mål för RNAi-applikation vid astmabehandling och ge en ny aveny för genterapi av astma.

bekräftelser

denna studie stöddes av ett öppet projekt bidrag från State Key Laboratory of Respiratory Disease (Guangzhou,Kina) (grant no. 2007da80154f1107).

	Locksley RM: astma och allergiskinflammation. Cell. 140:777–783. 2010. Visa Artikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Holgate ST: medfödda och adaptiva immunsvar vid astma. Nat Med. 18:673–683. 2012. Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	larch Ukrainian m, Robinson DS och Kay AB: rollenav T-lymfocyter i patogenesen av astma. J Allergi ClinImmunol. 111:450–464. 2003. Visa Artikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lambrecht BN och Hammad H: rollen avdendritiska och epitelceller som huvudregulatorer för allergiskluftvägsinflammation. Lancet. 376:835–843. 2010. Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Holt PG och Upham JW: rollen avdendritiska celler i astma. Curr Opin Allergi Clin Immunol. 4:39–44.2004. Visa Artikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lim TS, Goh JK, Mortellaro A, Lim CT,h usci Mmerling GJ och Ricciardi-Castagnoli P: CD80 och Cd86reglerar differentiellt mekaniska interaktioner mellan T-celler medantigenpresenterande dendritiska celler och B-celler. PLoS One.7:. Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Wong CK, Lun SW, Ko FW, Ip WK, Hui DS andLam CW: Ökat uttryck av plasma och cellytaekostimulerande molekyler CTLA-4, CD28 och CD86 hos vuxna patientermed allergisk astma. Clin Exp Immunol. 141:122–129. 2005.Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Shi HZ, Xie ZF, Deng JM, Chen YQ och XiaoCQ: lösligt CD86-protein i serumprover av patienter med astma.Bröstkorg. 59:870–875. 2004. Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Van Rijt LS och Lambrecht BN: Dendritiskceller i astma: en funktion utöver sensibilisering. Clin Exp Allergi.35:1125–34. 2005. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Van Rijt LS, Vos N, Willart M, Kleinjan A,Coyle AJ, Hoogsteden HC och Lambrecht BN: viktig roll fördendritisk cell CD80/CD86 costimulering i induktionen, men intereaktivering, av Th2-effektorsvar i en musmodell av astma.J Allergi Clin Immunol. 114:166–173. 2004. Visa Artikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wu SG, Wang GL, Li LY och Ji J: effekter avmikrorna-21 på interleukin 12/signalomvandlare och aktivatorav transkription 4 signalväg i astmatiska möss. Cent Eur JImmunol. 39:40–45. 2014. Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Gu X, Xiang J, Yao Y och Chen Z: Effectsof RNA-interferens på CD80-och CD86-uttryck i bonemarrow-härledda murina dendritiska celler. Scand J Immunol. 64:588–594.2006. Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Livak KJ och Schmittgen TD: analys avrelativ genuttrycksdata med hjälp av kvantitativ PCR i realtid och2-kazakiska ct−metoden. Sätt. 25:402–408. 2001. Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Fanta CH: astma. N Engl J Med.360:1002–1014. 2009. Visa Artikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lambrecht BN och Hammad H: Lungdendritikceller i respiratorisk virusinfektion och astma: från skydd tillimmunopatologi. Annu Rev Immunol. 30:243–270. 2012. Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Wenzel SE: astma fenotyper: utvecklingen från kliniska till molekylära tillvägagångssätt. Nat Med.18:716–725. 2012. Viewartikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Hansel TT, Johnston SL och Openshaw PJ:mikrober och mukosala immunsvar vid astma. Lancet.381:861–873. 2013. Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Compalati e, Braido F och Canonica GW: Anupdate på allergenimmunterapi och astma. Curr Opin Pulm Med.20:109–117. 2014. Visa Artikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Goyvaerts C, Dingemans J, De Groeve K,Heirman C, Van Gulck E, Vanham G, de Baetselier P, Thielemans K,Raes G och Breckpot K: inriktning av humant antigenpresenterande cellsubset. J Virol. 87:11304–11308. 2013. Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Reise Sousa C: dendritiska celler i en mognad. Nat Rev Immunol. 6:476–483. 2006. Viewartikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Gill MA: rollen av dendritiska celler iastma. J Allergi Clin Immunol. 129:889–901. 2012. Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Shi JH, LI YG och LI TS: rollerna fördendritiska celler i antigenpresentation och patogenesen avastma. Zhonghua Jie Han Han Hu Xi Za Zhi. 28:22–27. 2005.(Kinesiska). PubMed/NCBI
	Wong CK, Lun SW, Ko FW, Ip WK, Hui DS ochlam CW: ökat uttryck av plasma-och cellytaceco-stimulerande molekyler CTLA-4, CD28 och CD86 hos vuxna patientermed allergisk astma. Clin Exp Immunol. 141:122–129. 2005.Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Bellou A och Finn PW: Costimulering:kritiska vägar i immunologisk reglering av astma. CurrAllergy Astma Rep. 5: 149-154. 2005. Visa Artikel : Google Scholar: PubMed/NCBI
	Chen YQ och Shi HZ: CD28/CTLA-4-CD80/Cd86och ICOS-B7RP-1 costimulatory väg i bronkial astma. Allergivänlig.61:15–26. 2006. Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Bieber t, Novak N, Herrmann N och Koch S:roll av dendritiska celler i atopisk dermatit: en uppdatering. Clin RevAllergy Immunol. 41:254–258. 2011. Visa Artikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Hespel C och Moser M: rollen av inflammatoriskadendritiska celler i medfödd och adaptiv immunitet. Eur J Immunol.42:2535–2543. 2012. Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Novak n: en uppdatering om människans rolldendritiska celler hos patienter med atopisk dermatit. J Allergi ClinImmunol. 129:879–886. 2012. Visa Artikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lombardi V, Singh AK och Akbari O: Therole av costimulatoriska molekyler vid allergisk sjukdom och astma. Intark Allergi Immunol. 151:179–189. 2010. Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Zhang y, Zhou X och Zhou B: DC-derivedTSLP främjar Th2-polarisering i LPS-primad allergisk luftvägsinflammation. Eur J Immunol. 42:1735–1743. 2012. Visa Artikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Crosby JR, Guha M, Tung D, Miller DA,Bender B, Condon TP, York-DeFalco C, Geary RS, Monia BP, Karras JGand Gregory SA: inhalerad CD86 antisense oligonukleotid suppressespulmonary inflammation och luftvägs HYPERRESPONS i allergiskmöss. J Pharmacol Exp Ther. 321:938–946. 2007. Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	brand A, xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE och Mello CC: Potent och specifik genetisk störning avdubbelsträngat RNA i Caenorhabditis elegans. Natur.391:806–811. 1998. Visningartikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Ghafouri-Fard S: siRNA och cancerimmunoterapi. Immunterapi. 4:907–917. 2012. Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Gavrilov K och Saltzman WM: TherapeuticsiRNA: principer, utmaningar och strategier. Yale J Biol Med.85:187–200. 2012.PubMed/NCBI
	Yan WJ, Xu SJ, Xie MM och Wu BL: effekter av exogent cykliskt dimeriskt guanosinemonofosfat på genuttryck av Streptococcus mutans. Zhongguo Zu Zhi GongCheng Yan Jiu. 16:1451–1454. 2012.(På Kinesiska).
	Lee CC, Huang HY och Chiang BL:Lentiviralmedierad interleukin-4 och interleukin-13 RNAinterference minskar luftvägsinflammation och hyperrespons.Hum Gene Ther. 22:577–686. 2011. Visa Artikel : Google Scholar: PubMed/NCBI
	Li Y, Sun M, Cheng H, Li S, Liu L, Qiao H,Hua S och Lu J: tysta il-23-uttryck med en liten hårnål Rnskyddar mot astma hos möss. Utg. Dat Mol Med. 43:197–204. 2011.Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Woska JJ och Gillespie ME:små interfererande RNA-medierad identifiering och reglering av theternary SNARE complex mediating RBL-2h3 mastcell degranulering.Scand J Immunol. 73:8–17. 2011. Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Lu XX, McCoy KS, Xu JL, Hu WK och Chen HB:liten interfererande RNA som riktar sig mot T-cell ig mucin-3 minskarallergisk luftvägsinflammation och hyperresponsivitet. Inflammation.36:582–591. 2013. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Darcan-Nicolaisen Y, Meinicke H, Fels G,Hegend O, Haberland A, K Excepihl A, Loddenkemper C, Witzenrath M, KubeS, Henke W och hamelmann e: Liten störande RNA mottranskriptionsfaktor STAT6 hämmar allergisk luftvägsinflammationoch hyperreaktivitet hos möss. J Immunol. 182:7501–7508. 2009.Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Moriwaki A, Inoue H, Nakano T, Matsunagay, Matsuno Y, Matsumoto T, Fukuyama S, kan-O K, Matsumoto K,Tsuda-Eguchi M, et al: T-cellbehandling med liten störande RNAFOR-suppressor av cytokinsignalering 3 modulerar allergiska luftvägar i en murinmodell av astma. Am J Respir Cell Mol Biol.44:448–455. 2011. Visa artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Zheng YH, Lu JJ, Guo ZL, Ren T och LiangYJ: små störande RNA som är specifika för mjälte tyrosinkinasinhibit mognad av dendritiska celler av astmatiska möss in vitro.Zhongguo Hu Xi Yu Wei Zhong Jian Hu Za Zhi. 8:487–491. 2009.(Kinesiska).
	Li JG, Zhuansun YX, Ran PX, Zhang W, MoXN, Wu H och Li YQ: Effekter av benmärgsmesenkymala stamcellerpå CD4 + CD25 + regulatoriska T-celler och luftvägsinflammation hos astmatiska möss. Zhongguo Zu Zhi Gong Cheng Yan Jiu.12:9302–9305. 2008.(På Kinesiska).