förekomst av multiresistent Escherichia coli isolerad från dricksvattenkällor

Abstract

kontrollen av infektionssjukdomar är allvarligt hotad av ökningen av antalet mikroorganismer som är resistenta mot antimikrobiella medel. Detta beror på att infektioner orsakade av resistenta mikroorganismer ofta inte svarar på konventionell behandling, vilket resulterar i långvarig sjukdom och större risk för dödsfall. Antimikrobiella resistenta bakterier finns också i olika vattenkällor. Denna studie försökte därför dokumentera mikrobiologisk kvalitet och antibiogram av bakterieisolat (E. coli-stammar) från sex olika vattenkällor för att bestämma deras säkerhet för konsumtion och för att tillhandahålla uppdaterade antibiotikadata för pragmatisk behandling av patienter. Bakterieisolering och identifiering gjordes med hjälp av API och konventionella metoder. Antibiotikaresistensprovning utfördes med Kirby-Bauer-metoden. Resultaten visade att alla testade vattenkällor var av dålig kvalitet. Isolerade bakterier inkluderade E. coli, Enterobacter spp., Klebsiella spp., Salmonella typhi, Streptococcus spp., Proteus vulgaris, Vibrio cholera, Shigella spp., Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis. The prevalence of multidrug-resistant E. coli was 49.48%. E. coli isolates showed high resistance patterns to the tested antibiotics. They were most resistant to penicillin (32.99%), cefuroxime (28.87%), erythromycin (23.71%), and tetracycline (21.45%). In contrast, they were susceptible to nitrofurantoin (93.8%), cefotaxime and amikacin (91.75%), gentamicin (90.7%), nalidixic acid (89.65%), ciprofloxacin (74.2%), chloramphenicol (69.07%), pipemidsyra (65,97%) och cefuroxim (52,58%). Sextiotre procent (63%) av de multidrugsresistenta E. coli-stammarna registrerade ett indexvärde för multipel antibiotikaresistens (MAR) >0.2. De mottagliga antibiotika, särskilt nitrofurantoin, rekommenderas därför vid praktisk behandling av vattenburna bakteriesjukdomar.

1. Inledning

antibiotika är utan tvekan den mest framgångsrika formen av kemoterapi som utvecklats under 20-talet och räddar otaliga människoliv varje dag . Framväxten av antibiotikaresistenta bakterier begränsar den kliniska användningen av antibiotika och, som resistenta bakterier blir vanligare, finns det ökande oro för att befintliga antibiotika blir ineffektiva mot dessa patogener och dyrare .

antibiotikaresistenta gener som ger resistens mot en mängd olika antibiotika har identifierats i ett stort antal vattenmiljöer inklusive dricksvatten i både utvecklade länder och utvecklingsländer . Den största risken för folkhälsan är att resistensgener överförs från miljöbakterier till mänskliga patogener. Dricksvattnets potential att transportera mikrobiella patogener till ett större antal människor, vilket orsakar efterföljande sjukdom, är väl dokumenterad i länder på alla nivåer av ekonomisk utveckling . Dessutom är tillgången på säkert dricksvatten en oumbärlig funktion för att förebygga epidemiska sjukdomar och förbättra livskvaliteten . Enligt Världshälsoorganisationen tillskrivs 80% av alla sjukdomar osäkert vatten . Särskilt utvecklingsländerna plågas av vattenrelaterade sjukdomar som diarre som står för 10% av sjukdomsbördan i sådana länder .

Escherichia coli är medlem i feacal coliforms som förorenar dricksvatten från människors och djurs feacal avfall. E. coli har varit den främsta indikatorn på fekal kontaminering i vattenkvalitetsövervakning i många årtionden. Under regn kan dessa koliformer tvättas i bäckar, floder, bäckar, sjöar eller grundvatten. Obehandlat dricksvatten från dessa källor innehåller koliformer inklusive E. coli.

E. coli har också visat sig vara en signifikant reservoar av gener som kodar för antimikrobiell läkemedelsresistens och är därför en användbar indikator för resistens i bakteriesamhällen . Även om det finns flera studier som bedömer multidrugsresistens (MDR) i E. coli-populationer av animaliskt ursprung, har inte mycket arbete gjorts på ekologin hos MDR . Spridningen av MDR i miljöer där antibiotika inte används är en möjlighet som ännu inte har undersökts väl, även om det har antagits att vatten kan sprida antimikrobiell resistens . Syftet med denna studie är att bestämma antibiotikakänslighetsmönstret och det multipla antibiotikaresistensindexet för E. coli-stammar isolerade från sex dricksvattenkällor under bakteriologisk övervakning under ett år.

2. Material och metoder

2.1. Provtagningsplatser

efter flera preliminära besök i olika samhällen i distrikten valdes 57 provtagningsplatser bestående av sex olika vattenkällor som inkluderar dammar, borrhål, strömkällor, floder, kanaler och handgrävda brunnar i 27 samhällen. Prover togs från platser som var representativa för de vattenkällor och/eller distributionsnät från vilka vatten levereras till invånarna och/eller användningsställen baserade främst på faktorer som befolkning och användningsgrad eller nivå av beskydd av vatten från dessa källor. De flesta samhällen domineras av bönder. Varje samhälle som valts hade åtminstone ett borrhål eller en bäck som de viktigaste vattenkällorna för invånarna.

2.2. Platsobservationsdetaljer

före vattenprovtagning gjordes viktiga observationer runt provtagningsplatserna. Dessa observationer inkluderade sanitära förhållanden samt möjliga föroreningskällor, vilket kan påverka vattenkvaliteten från de provtagna källorna.

fältposter för följande miljöfaktorer registrerades också: vattnets klarhet/grumlighet (visuell klarhet i vattnet, dvs löv, skräp och alger), väderförhållanden (temperatur, vind och nederbörd), närvaro av djur (Fåglar/Ankor) och andra kommentarer (t.ex. systemproblem, dvs desinfektion / filtreringsutrustning och fekalolyckor).

2.3. Provstorlek och provtagningsfrekvens

totalt ett hundra tjugotvå vattenprover samlades in för bedömning mellan juni 2011 och maj 2012. Provsamlingsperioden sträckte sig över de två säsongerna i Ghana, det vill säga de torra och regniga årstiderna. Alla vattenprovtagnings-och konserveringsförfaranden utfördes enligt standardmetoder för undersökning av vatten och avloppsvatten och WHO: s riktlinjer för dricksvattenkvalitet . Provtagning för bakteriologisk analys gjordes aseptiskt med försiktighet, vilket säkerställde ingen extern kontaminering av prover. Alla prover transporterades till laboratoriet inom 2 timmar.

2.4. Bakterieisolering och identifiering

alla grampositiva organismer identifierades med konventionella metoder såsom gramfläck, positivt katalas, rörkoagulas, deoxiribonukleaser (DNAse)-test och så vidare, medan ett API 20e-kit användes för att identifiera den gramnegativa organismen. E. coli stam 25922 användes som den positiva kontrollen för E. coli-isolaten.

2,5. Antibakteriell Känslighetstestning av E. coli

var och en av isolaten (E. coli) utsattes för antibiotikaresistensprovning med Kirby-Bauer-metoden som har standardiserats och utvärderats med metoderna från National Committee for Clinical Laboratory Standards . Isolat odlade över natten på näringsagar suspenderades i steril normal saltlösning (0,9% w/v NaCl) med användning av en steril trådslinga tills grumligheten motsvarade 0,5 Mcfarland-standarder. Sterila icke-toxiska bomullspinnar doppade i den standardiserade inokulaen användes för att strimma hela ytan av Mueller–Hinton agarplattor. E. coli-isolaten sedan testas mot fjorton antibiotika enligt följande: ampicillin (10 µg), pipemidic syra (20 ug), kloramfenikol (30 µg), ciprofloxacin (5 µg), co-trimoxazole (25 µg), erytromycin (15 µg), nitrofurantoin (300 mikrogram), penicillin (10 IU), cefuroxim (30 µg), cefotaxime (30 µg), nalidixic acid (30 µg), amikacin enligt (30 µg), tetracyklin (30 µg), och gentamicin (10 mikrogram). Antibiotiska skivor placerades aseptiskt med användning av sterila pincett och alla plattor inkuberades (Gallenkamp England, modell ih-150) vid 37 CCB i 24 timmar . Resultaten tolkades med hjälp av NCCLS .

3. Resultat

resultat från Tabell 1 visar att totalt femhundra tjugo bakterieisolat (520) erhölls under studietiden. Ett betydande antal isolat (305) som representerade 58,65% av det totala erhölls under torrsäsongen, jämfört med (205) som representerade 41,35% under regnperioden.

den vanligaste organismen i vattenproverna var Klebsiella spp. (104), vilket motsvarar 20% av det totala antalet erhållna isolat. Det högsta antalet Klebsiella spp. (18) isolerades från strömvattenkällor under den torra säsongen och den lägsta (1) från floder under regnperioden. Den näst mest förekommande organismen var E. coli (97), vilket motsvarade 18,7% av de totala bakterieisolaten. Detta följdes av Pseudomonas aeruginosa (15, 61%), Enterobacter spp. (15,4%), Proteus vulgaris (13,1%) och Enterococcus faecali (9,2%). Den minst isolerade organismen var Vibrio cholerae (1,2%) och Shigella spp. (1.2%). Vibrio cholerae isolerades i fyra vattenkällor, nämligen ström, borrhål, handgrävda brunnar och dammvattenkällor, medan Shigella spp. isolerades i 3: ström, borrhål, och dammvattenkällor.

totalt ett hundra tjugotvå vattenprover samlades in för den bakteriologiska analysen. Resultat från Tabell 2 visar att nittiosju E. coli-stammar isolerades under studieperioden. Femtioåtta stammar som representerade 59,79% isolerades under torrsäsongen jämfört med trettionio som representerade 40,21% under regnperioden. Det högsta antalet stammar isolerade från en enda vattenkälla var från dammar (28) som representerar 29%. Detta följdes av strömvattenkällor (26) som representerar 27%, handgrävda brunnar (24) som representerar 25% och borrhålsvattenkällor (11) som representerar 11%. Flodvattenkällor producerade minst antal isolerade stammar (2) som representerar 2% och sedan kanalvattenkällor (6) som representerar 6%. De högsta isolaten under regnperioden erhölls från dammar (12) följt av strömvattenkällor (10) och handgrävda brunnar (10). Det högsta antalet isolat under torrsäsongen erhölls från dammar (16) följt av strömvattenkällor (17). Det minsta antalet isolat under regnperioden erhölls från kanaler (3) följt av borrhålsvattenkällor (4). Ingen E. coli-stam isolerades från flodvattenkällor. Det minsta antalet isolat under torrsäsongen erhölls från floder (2) följt av kanalvattenkällor (3).

Results from Table 3 reveal the antibiotic susceptibility profile of the E. coli strains. Alla stammar testades mot 14 olika antibiotika, med användning av Kirby–Bauer skivdiffusion, standardiserad och utvärderad med metoderna för National Committee for the Clinical Laboratory Standards . Tabell 3 visar att E. coli-stammar var mest resistenta mot penicillin (32) representerande 32,99%, följt av cefuroxim (28) representerande 28%, erytromycin (23) representerande 23,71%, tetracyklin (21) representerande 21,45%, kloramfenikol (18) representerande 18,65%, pipemidinsyra (13) representerande 13,40% och ampicillin (11) representerande 11,32%. Sju av de fjorton antibiotika hade tio eller mindre antal isolat som visade resistens. Fyra isolat som representerade 4,12% var resistenta mot vart och ett av följande antibiotika: cefotaxim, nalidixinsyra och nitrofurantoin. Detta följdes av gentamicin (5) som representerar 5,15%, amikacin (7) som representerar 7,2%, ciprofloxacin (8) som representerar 8,5% och slutligen co-trimoxazol (8) som representerar 8,5%. Tabell 3 visar att E. coli-stammar var mest mottagliga / känsliga för nitrofurantoin (91) som representerade 93,8%, och detta följdes av cefotaxim och amikacin (89) som representerade 91.75%, gentamicin (88) som representerar 90,7%, nalidixinsyra (87) som representerar 89,65%, ciprofloxacin (72) som representerar 74,2%, kloramfenikol (67) som representerar 69,07%, pipemidinsyra (64) som representerar 65,97% och cefuroxim (CXM) (51) som representerar 52,58%. Fyra av de fjorton antibiotika hade femtio eller mindre antal isolat som visade resistens. De var penicillin (14), tetracyklin (29), ampicillin (45) och erytromycin (50).

Analysis of multiple drug resistance of E. coli-isolat från vattenkällorna avslöjar att fyrtioåtta isolat som representerar stor andel (49,48%) av E. coli-isolat uppvisade resistens mot två eller flera antibiotika, vilket klassificerades som multidrugsresistens. Detta skapar ett stort folkhälsoproblem.

4. Diskussion

förekomsten av E. coli i de olika vattenkällorna kan stava hälsorisker såsom diarrhoeal sjukdomar som står för en väsentlig grad av sjuklighet och dödlighet hos vuxna och barn . Kontroll av diarre kan kräva administrering av antibiotika. Ändå är flera stammar av E. coli kända för att vara resistenta mot ett brett spektrum av antibiotika . Flera antibiotikaresistens avser resistens mot antingen två eller flera klasser av antibiotika. De multipla antibiotikaresistenserna hos E. coli som fastställts i denna studie överensstämmer med andra fynd . Stammar av E. coli och Salmonella spp. stod för flera utbrott i USA och över hela världen, delvis på grund av resistens mot kloramfenikol, ampicillin och trimetoprim .frekvensen av penicillinresistens i den aktuella studien var hög bland isolaten jämfört med kloramfenikol och ampicillinresistens observerad i isolaten erhållna från de olika vattenkällorna. Detta kan bero på filt användning av billiga antibiotika i Ghananska samhället eller kan bero på produktion av beta-laktamas enzymer. E. coli-resistens mot ampicillin observerades av Chucilebi et. al. , Olowe et al. , och Yurdakoek et al. . Den framväxande co-trimoxazol-och ciprofloxacinresistensen från nedströmsställen är av allvarlig oro, eftersom dessa är de föredragna läkemedlen för många gramnegativa bakterier . Den vanligaste mekanismen för resistens mot co-trimoxazol är förvärvet av plasmidmedierade, variant diaminopyrimidinfolatreduktasenzymer . Låg resistens mot amikacin och gentamycin kan bero på mindre användning av dessa antibiotika i klinisk praxis och/eller veterinärmedicin. Den stigande resistenstrenden i alla isolat (totala och fekala koliformer) från uppströms till nedströms bekräftar det faktum att bortskaffade antibiotika kan ha tvättats ner i vattenkällorna och ackumulerats nedströms särskilt under regnperioden och står för hög resistans.

skillnaderna i motståndsprofiler i denna miljöstudie återspeglar tydligt skillnaderna i urvalsprocedurens tryck på de undersökta platserna/områdena. Den högre resistensen mot antibiotika bland koliformer av midstream och nedströms platser i Ghananska samhällen är oroande eftersom de flesta invånare tar bad, tvättar kläder och till och med placerar mänskligt avloppsvatten i vattenkällor vid midstream och nedströms platser medan vissa passagerare och icke-upptagna använder dessa vattenkällor för dricks-och/eller hushållsändamål. I Mangalore, det rapporteras att obehandlat eller delvis behandlat hushållsavlopp släpps ut i öppna flodmynningar som står för den höga nivån av antibiotikaresistens .

multidrugsresistens definieras som resistens mot alla testade antibiotika i minst två av följande tre klasser: laktamer, aminoglykosider och kinoloner . Isolatens multidrugsresistens (MDR) tecken identifierades genom att observera isolatens resistensmönster mot antibiotika. Mar-indexet för ett isolat definieras som a/b, där a representerar antalet antibiotika som isolatet var resistent mot och b representerar antalet antibiotika som isolatet utsattes för . Mar-indexanalysen avslöjar att trettio av de multidrugsresistenta E. coli-stammarna hade ett mycket högt Mar-indexvärde (>0.2). Det höga Mar-index som registrerats i denna studie avser det faktum att vattenkällorna kan ha varit mycket förorenade med antibiotika på grund av den höga användningen av dessa kemikalier i de omgivande områdena i de olika vattenkällorna. Detta är i enlighet med Tambekar et al.’s rapport som säger att bakterier som härrör från en miljö där flera antibiotika används brukar producera MAR index större än 0,2. Mar indexering nedan 0.2 bestämd i denna studie var faktiskt under det ologiska värdet av riskförorening . Prover som gav Mar-indexering över 0,2 indikerade emellertid hög risk för kontaminering. Skillnaden i Mar-indexering i de olika vattenkällorna indikerade urbaniseringens inverkan på antibiotikaresistensnivåer.

mikrobiologisk kvalitet hos de olika analyserade vattenkällorna var låg eftersom olika bakteriestammar isolerades med olika frekvenser. I större utsträckning detekterades skillnader i antibiotikaresistensfrekvenser i E. coli-stammar från olika vattenkällor så att vissa E. coli-stammar var mycket resistenta mot cefotaxim, nalidixinsyra, nitrofurantoin, gentamicin, amikacin, ciprofloxacin och co-trimoxazol. Skillnaderna i antibiotikastammar från de olika vattenkällorna kan återspegla den specifika användningen av antibiotika runt den angivna källan. Den höga förekomsten av penicillin-och kloramfenikolresistens som registrerats utgör ett allvarligt folkhälsoproblem eftersom dessa antibiotika har mindre chans att bota infekterade patienter som använder de undersökta vattenkällorna som dricksvatten eller för hushållsändamål. Faktum är att den ökande förekomsten av resistens i isolaten, särskilt av det mänskliga ursprunget, kan ha en viktig terapeutisk implikation som kräver försiktighet vid oskälig användning av antibiotika på människor. Men nästan alla 97 stammar av E. coli var mottagliga för vissa antibiotika, nämligen nitrofurantoin (93.8%), följt av cefotaxim och amikacin (91,75%), gentamicin (90,7%), nalidixinsyra (89,65%), ciprofloxacin (74,2%), kloramfenikol (69,07%), pipemidinsyra (65,97%) och slutligen av cefuroxim (52,58%).

höga och låga Mar-indexvärden registrerades i studien, vilket indikerar risknivån för kontaminering av de provtagna vattenkällorna, vilket kräver mer restriktiva policyer för bortskaffande av avlopp från människor/djur och bad/tvätt i eller nära vattendrag. Slutligen är periodisk övervakning av vattenkällornas antibiotikakänslighet av betydelse för att upptäcka eventuella förändrade mönster som kan uppstå i framtiden för att hålla jämna steg med sådana förändrade mönster för bättre botande åtgärder eller policyformulering och genomförande.

datatillgänglighet

de data som används för att stödja resultaten av denna studie är tillgängliga från motsvarande författare på begäran.

intressekonflikter

författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.

bekräftelser

författarnas uppriktiga uppskattning går till personalen vid Institutionen för mikrobiologi vid Noguchi Memorial Institute for Medical Research, University of Ghana, för deras hjälp under laboratorieanalysen av vårt arbete. Författarna ville också erkänna de enorma resurser som erhållits från avhandlingen ”Radiation sensitivity and molecular characterization of water-borne multidrug resistant Escherichia coli” mot detta arbete.