Definition
fluorescerande märkning är processen att binda fluorescerande färgämnen till funktionella grupper som finns i biomolekyler så att de kan visualiseras genom fluorescensavbildning (nature.com). tillgängligheten av nya fluoroforer har dramatiskt förändrat möjligheterna för känslig detektering av biomolekyler och analysen av deras interaktioner. Förbättrade fluorescerande färgämnen möjliggör nu tidigare omöjliga studier av cellulära strukturer och cellulära processer. Fluorescerande etiketter erbjuder många fördelar, eftersom de är mycket känsliga även vid låga koncentrationer, är stabila under långa tidsperioder och inte stör målmolekylernas funktion. Den riktade avbildningen av märkta celler möjliggör spårning av dem in vitro och in vivo. Användning av olika fluoroforer i samma prov kan också möjliggöra samtidig observation av flera molekyler samtidigt. De vanligaste fluoroforerna är Fluoresceinisotiocyanat (FITC), derivat av rhodamin (TRITC), kumarin och cyanin. Dessa syntetiska organiska färgämnen används för att märka biomolekyler som proteiner, peptider, antikroppar, nukleinsyror, bakterier eller jäst. Naturligt förekommande fluorokromer, såsom grönt fluorescerande Protein (GFP), kan också användas för att märka levande celler genetiskt.
- fluorescerande proteinmärkning
fluorescerande märkning tillåter forskare att undersöka konformationsdynamiken och molekylära interaktioner av proteiner eller att spåra deras rörelser för att bättre förstå deras biologiska funktioner (Modesti M, 2011). För att få bättre insikt i receptor-ligandbindning, proteinstrukturer och enzymaktivitet kan enstaka peptider också märkas. Fluorokrommärkta antikroppar används ofta i biomedicinsk forskning för att detektera antigener i immunofluorescensanalyser och är också viktiga verktyg i immunodiagnostik. För att säkerställa tillförlitliga resultat bör fluorofor-konjugationen inte störa antikroppens antigenbindande egenskaper (Nath n et al, 2016). - fluorescerande märkning av nukleinsyror
Fluorescensbaserade analyser spelar en viktig roll i biofysiska studier av nukleinsyrornas struktur, funktion och dynamik. Nya framsteg inom märkningsmetoder och bildsystem har möjliggjort direkt in vivo-observation av DNA och RNA och deras interaktioner med andra cellkomponenter. Levande cellavbildning av nukleinsyror har öppnat nya vägar för bättre förståelse av kromatinorganisation och genuttrycksreglering. (Dirks RW et al, 2018). - fluorescerande märkning av polysackarider
komplexa polysackarider, såsom heparin är strukturella komponenter i den extracellulära matrisen. Dessa polysackarider är väsentliga för cellulär vidhäftning, migration och tillväxt (Prigent-Richard S. et al, 1998). Vissa föreningar är också kända för deras antikoagulerande, antitrombotiska, antiinflammatoriska, antivirala och antiangiogena egenskaper. Fluorescensbaserade metoder gör det lättare att identifiera nya bioaktiva polysackarider och att karakterisera deras biologiska funktioner (Roger O et al, 2002). - fluorescerande märkning av lipider
cellulära lipider spelar en avgörande roll i cellen för energilagring, för bildning av cellulära membran och för intracellulära signalprocesser (Maekawa M. och Fairn G, 2014). Det lipofila färgämnet Nile red används ofta för att fläcka intracellulära lipider för att analysera deras placering och organisation (Greenspan P et al, 1985). För att studera lipiddynamik är dessutom specifik märkning i levande celler också möjlig (Schultz C et al, 2010).
fluorescerande Märkningstekniker
vanligen använda fluorescerande märkningsmetoder använder kemiska, enzymatiska, peptid / protein tag och genetiska märkningstekniker (Sahoo H, 2012 , Toseland CP, 2013).
- kemiska märkningstekniker: Fluoroforer dockar till målmolekylerna genom kemisk modifiering (kovalent eller icke-kovalent bindning). Kemiska märkningsmetoder har flera fördelar eftersom de är robusta, enkla att utföra och mycket effektiva med ett brett spektrum av fluoroforer. De är mer lämpade för in vitro-studier snarare än in vivo.enzymatiska märkningstekniker: enzymatiska reaktioner möjliggör snabb, högeffektiv och selektiv märkning in vivo och in vitro och kan användas för att rikta proteiner eller hela celler. Men på grund av etikettens stora storlek kan störningar med målmolekylernas funktion uppstå.
- peptid / protein tag: en nyutvecklad och mycket lovande teknik möjliggör specifik och selektiv märkning av proteiner genom införlivande av korta fluorescerande taggar som inte stör molekylens vikning eller funktion. Denna teknik är också lätt att utföra och kan användas för att undersöka olika ställen för enskilda proteiner beroende på peptidtaggspecificitet.
- genetisk märkning: genetisk märkning kan uppnås med hjälp av proteindomäner, små peptider eller enstaka aminosyror som är märkta med fluorescerande färgämnen och kan specifikt fästa vid platser längs kromosomer in vivo. Detta tillvägagångssätt möjliggör detektering av kromosomala abnormiteter såsom raderingar eller dubbelarbete.
- flerfärgad märkning: Ett vanligt krav för levande cellavbildning och för flödescytometriapplikationer är förmågan att följa eller detektera flera fluorescerande märkta proteiner samtidigt. För detta ändamål kan speciellt utformade färgämnen med ett mycket stort Stokes-Skift användas, vilket möjliggör samtidig övervakning av olika biokemiska processer.
Fluorescensbaserade analyser
Fluorescensbaserade analyser förlitar sig på förmågan hos fluoroforer att återge ljus efter exponering för ljuspartiklar eller fotoner. Skillnaden i våglängd mellan excitationsljus och emissionsljus, den så kallade Stokes shift, kan detekteras i mikroskop och bildsystem. Varje fluorofor har ett specifikt Stokes-Skift. Olika analyser gör det möjligt för forskare att lokalisera biomolekyler, observera dem i realtid, undersöka deras interaktioner och studera enzymatiska aktiviteter.
- fluorescensmikroskopi
fluorescensmikroskopi möjliggör identifiering av celler och cellkomponenter och övervakning av cellfysiologi med hög specificitet. Fluorescensmikroskopi separerar emitterat ljus från exciteringsljus med hjälp av optiska filter. Användningen av två indikatorer möjliggör också samtidig observation av olika biomolekyler samtidigt. Medan konventionella avbildningssystem tillåter en upplösning av 200 till 300 nm på grund av fysiska diffraktionsgränser, nya superupplösningsfluorescensmikroskop som STED (stimulerad utsläppsutarmning) övervinna dessa gränser och ge insikter i nanoskalans värld av molekyler (Sanderson MJ et al, 2014). - flödescytometri
flödescytometri används ofta i grundforskning och klinisk praxis för att mäta signalen från specifika fluoroforer. Celler och partiklar analyseras och sorteras så småningom i ”realtid” när de passerar genom ljusstrålen av detektorer som kvantifierar fluorescensen som produceras av märkta antikroppar eller ligander. Dessa markörer binder till specifika molekyler på cellytan eller inuti cellen så att de kan detekteras och kvantifieras. Flera parametrar som storlek och volym kan mätas på enskilda celler, och olika celltyper kan isoleras och karakteriseras (Nolan JT och Condello D, 2013). Flödescytometri finner breda tillämpningar inom områden som immunologi, hematologi, transplantationsmedicin, onkologi och genetik. - fluorescens in situ hybridisering(FISH)
fluorescens in situ hybridisering (FISH) möjliggör lokalisering av specifika DNA-sekvenser på kromosomer. Fluorescerande DNA-eller RNA-prober används för att hybridisera och identifiera komplementära mål-DNA-sekvenser. Fisk har traditionellt använts för att kartlägga gener på kromosomer, till exempel under Human Genome Project. Idag används fluorescens in situ hybridisering huvudsakligen för diagnostiska ändamål vid detektering av kromosomavvikelser eller vid analys av cancerceller (O ’ Connor C, 2008). - Fluorescenskorrelationsspektroskopi(FCS)
Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) möjliggör analys av tidsmässiga förändringar i fluorescensintensiteten hos fluorokromer, som orsakas av kemiska, biologiska eller fysiska influenser. FCS introducerades först för att undersöka interaktion mellan läkemedel och DNA och representerar nu ett känsligt verktyg för att bestämma koncentration och aggregeringsnivåer av proteiner, liksom för att observera molekylära interaktioner (Tian Y et al, 2011). - mikroarrayer
mikroarrayer tillåter studier av genuttryck under olika förhållanden. Tusentals gener kan undersökas samtidigt på DNA-chips. Dessa är mikroskopiska bilder tryckta med små fläckar som innehåller kända DNA-sekvenser som selektivt kan binda till fluorescerande märkta mRNA/cDNA-molekyler. Efter hybridisering läses DNA-chipet ut och data används för att skapa genuttrycksprofiler (Hoen PAC et al, 2003).
fluorescerande etikett: levande Cellavbildning
den kinetiska observationen av cellulära processer med hjälp av time-lapse fluorescensmikroskopi har blivit en grundläggande teknik i cellbiologi, eftersom levande cellavbildning kan ge mycket värdefulla insikter i celltillväxt och transportmekanismer. En stor utmaning i time-lapse-mikroskopi minimerar fototoxiska effekter till följd av fotoblekning. Ljusexponeringen förstör gradvis fluorescerande molekyler som leder till en minskning av fluorescenssignalen och till bildandet av fria radikaler som kan skada cellerna. Därför är det avgörande för metoden för levande cellavbildning att hitta en balans mellan att minska ljusexponeringen så mycket som möjligt och få användbara signaler för att observera cellerna. Forskare måste också skapa en fysiologisk miljö som gör det möjligt att noggrant replikera in vivo-dynamiken. (Ettinger och Wittmann T, 2014).
PromoCell fluorescerande märkning
tillgängligheten av nya fluoroforer har dramatiskt förändrat möjligheterna för känslig detektion av biomolekyler och analys av deras interaktioner. Förbättrade fluorescerande färgämnen möjliggör nu tidigare omöjliga studier av cellulära strukturer och cellulära processer. PromoCell erbjuder ett brett sortiment av högkvalitativa fluoroforer för fluorescerande märkning av olika biomolekyler: proteinmärkning, antikroppsmärkning, nukleinsyramärkning (DNA-märkning, RNA-märkning), samt kompletta märkningssatser och färdiga fluorescerande konjugat.
våra Promofluorfärger är kostnadseffektiva alternativ till välkända, ledande fluoroforer och spänner över våglängdsspektrumet från blått till långt rött. De visar en enastående fluorescensintensitet och fotostabilitet, en stark ljusabsorption, hög fluorescenskvantumutbyte och god vattenlöslighet och kan användas för fluorescensmikroskopi, fluorescerande in situ hybridisering (FISH), fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) och mikroarrayer (protein, DNA). Några av dem erbjuder ett extra stort Stokes-skift, vilket gör dem idealiska för flerfärgade märknings-eller flödescytometriapplikationer. Promofluorfärger finns tillgängliga t. ex. som NHS-estrar, maleimider och aminomodifierade etiketter redo för kovalent koppling eller som konjugat med biotin, falloidin och deoxynukleotider (dUTPs). Dessutom tillhandahåller vi också högkvalitativt Protein & Antikroppsmärkningssatser med olika Promofluorfärger.