gränser i farmakologi

introduktion

membranproteiner deltar i grundläggande fysiologiska händelser i varje biologiskt system från bakterier till människor. >50% av marknadsförda läkemedel riktar sig mot membranproteiner, medan den farmakologiska inriktningen av många andra membranproteiner anses vara potentiellt fördelaktig i många biomedicinska tillämpningar (Overington et al., 2006; y Babbelld Babbel m.fl., 2007; Arinaminpathy et al., 2009). De molekylära mekanismerna bakom deras funktion och reglering förblir emellertid i stort sett okända på grund av bristen på strukturell information. Faktum är att medan membranproteiner står för ~26% av det mänskliga proteomet, representerar deras strukturer endast 2% av strukturerna i Proteindatabanken (Fagerberg et al., 2010; Pandey et al., 2016). Flera hinder hindrar den strukturella undersökningen av membranproteiner, vilket kräver utveckling av toppmodern teknik för att belysa deras molekylära arkitekturer (Pandey et al., 2016; Masson et al., 2017; Hagn et al., 2018; Ravula och Ramamoorthy, 2019; Redhair et al., 2019). De största hindren är att deras överuttryck och rening och strukturstudier med de flesta tekniker (t.ex. röntgenkristallografi) förblir begränsade i många fall. Dessa hinder hindrar följaktligen den rationella utvecklingen av läkemedelskandidater som riktar sig mot sjukdomsrelaterade membranproteiner (Vinothkumar och Henderson, 2010; Lounnas et al., 2013; Marciano et al., 2014).

sekundära transportörer är membranbundna proteiner som selektivt katalyserar rörelsen av dåligt permeabla lösta ämnen (t. ex., joner, neurotransmittorer, droger) över cellmembranet, som stöder olika cellulära funktioner i hälsa och sjukdom. Sekundära transportörer överensstämmer med det alternerande åtkomstparadigmet, enligt vilket proteinligandbindningsfickan alternativt blir tillgänglig på motsatta sidor av membranet genom att anta de inåtvända (IF) och utåtvända (OF) staterna i följd (Jardetzky, 1966; Forrest et al., 2011). Nya genombrott i membranproteins strukturella biologi gav en mängd strukturer av membranbundna transportörer i olika konformationstillstånd (Drew och Boudker, 2016; Bai et al., 2017), ger insikter i deras transport-och lösningsmedelsigenkänningsmekanismer. De ger emellertid statiska ögonblicksbilder av en inneboende flerstegsprocess (Seeger, 2018). Således finns det ett växande behov av att utveckla nya metoder för att undersöka membranproteiner dynamik (Konermann et al., 2011; Smith et al., 2012; Sim et al., 2017; Mandala et al., 2018; Burke, 2019). Dessa inkluderar en kombination av molekyldynamik (MD) simuleringar (Roux et al., 2011; Zdravkovic et al., 2012; Zhekova et al., 2016; Zhekova et al., 2017; Harpole och Delemotte, 2018) med avancerade experimentella tekniker, inklusive spektroskopiska tekniker och enkelpartikelkryogen elektronmikroskopi (Smith et al., 2012; Pandey et al., 2016; Castell et al., 2018; Hagn et al., 2018; Ravula och Ramamoorthy, 2019; Sun och Gennis, 2019).

väte-deuteriumutbyte masspektrometri (HDX-MS) fick uppmärksamhet under de senaste åren för att studera membranproteiner dynamik, även om det har använts i årtionden för att karakterisera lösliga proteiner (Konermann et al., 2011; Vadas et al., 2017). HDX-MS övervakar tidsberoende utbyte av lösningsmedel D2O med proteiner ryggrad amidväten under nativa förhållanden. Deuteriumväxelkursen beror på lösningsmedlets tillgänglighet, sekundär struktur och strukturell styvhet (Konermann et al., 2011). Tillsammans med proteolytisk digestion och peptidseparation tillåter HDX-MS kvantifiering av växelkurser i korta proteinsegment, upp till upplösning av enstaka rester. Två stora fördelar med HDX-MS är att små proteinmängder (< 0.1 mg) krävs för analys och att kemisk proteinmärkning inte krävs, vilket undviker oönskade strukturella störningar. Här sammanfattar vi de senaste framstegen och applikationerna i användningen av HDX-MS för att studera transportörernas strukturella dynamik.

väte-Deuteriumutbytesmasspektrometriprinciper

HDX-MS-principer beskrivs kortfattat och kvalitativt nedan för att möjliggöra en diskussion om dess tillämpningar för att studera transportörer. För fördjupade förklaringar finns flera utmärkta granskningsartiklar tillgängliga (Konermann et al., 2011; Rand et al., 2014; Engen och Wales, 2015; Masson et al., 2017; Oganesyan et al., 2018; Masson et al., 2019; Redhair et al., 2019).

i HDX-experiment utbyter deuterium med labila proteinväten på ett tidsberoende sätt efter proteinutspädning i en D2O-buffert (Masson et al., 2017) (Figur 1). HDX-MS övervakar huvudsakligen utbytet av ryggradsamidväten eftersom i) vid neutralt pH utbyts de i priser som kan detekteras med HDX-MS (sekunder till dagar) och ii) deras utbyte kan effektivt släckas (Marcsisin och Engen, 2010; Gallagher och Hudgens, 2016). HDX-hastigheten beror på flera parametrar. Amidväten kan uppvisa ett ” stängt tillstånd ”som härrör från deltagande i stabila vätebindningar i sekundära strukturer eller från lösningsmedelstillgänglighet, vilket inte tillåter deras utbyte med lösningsmedelsdeuterium eller ett” öppet tillstånd ” där protonabstraktion, det hastighetsbegränsande steget för HDX, kan förekomma (Oganesyan et al., 2018). Dessutom har reaktionen en inneboende kemisk hastighetskonstant, som beror på pH, temperatur och restmiljö (Oganesyan et al., 2018).

övergången mellan de stängda och öppna tillstånden sker genom lokala händelser. Under inhemska förhållanden, där proteiner är väl vikta, beror HDX-hastigheten huvudsakligen på övergångshastigheten tillbaka till stängt tillstånd (Weis et al., 2006). Om den utfällda proteinregionen återgår till det stängda tillståndet med en hastighet som är mycket långsammare än den kemiska växelkursen observeras EX1-kinetik, vilket resulterar i korrelerat deuteriumupptag i närliggande rester. Detta resulterar i två populationer: en med låg m/z och en med hög m/z, vilket återspeglar peptider från proteinmolekyler som inte har och som har genomgått utbyte. Med tiden blir den höga m/z-befolkningen mer framträdande på bekostnad av den låga m/z-befolkningen. EX1-kinetik anses vara sällsynt i vikta proteiner under inhemska förhållanden, men kan induceras, till exempel genom tillsats av Denaturanter (Weis et al., 2006; Oganesyan et al., 2018). Om proteinet återgår till det stängda tillståndet med en hastighet mycket snabbare än den kemiska växelkursen observeras EX2-kinetik. Här beror utbytet på övergången av enskilda rester mellan det öppna och stängda tillståndet, som uppträder på ett okorrelerat sätt. Således observeras med tiden en enda population med gradvis ökande m/z-värden (Weis et al., 2006).

Efter deuteration släckes reaktionen vid fördefinierade tidpunkter genom att ändra pH från neutral (7) till pHmin (2,5-3), vilket resulterar i ~10 000–faldig reduktion i HDX (Konermann et al., 2011; Masson et al., 2017; Oganesyan et al., 2018); och genom att minska temperaturen från 25 till 0 kg C, vilket leder till ~14-faldig minskning av HDX (Englander, 2006; Oganesyan et al., 2018). Därefter digereras proteinet med användning av ett proteas och peptiderna separeras med användning av analytisk omvänd fas kromatografi. För närvarande ligger den stora tekniska flaskhalsen i HDX-MS-experiment i att erhålla en hög sekvenstäckning, som begränsas av motståndet mot matsmältningsenzymer och av proteolytiska tillstånd. Slutligen identifieras eluerade peptider med MS och graden av HDX beräknas baserat på de erhållna m/z-värdena. De experimentella detaljerna och fallgroparna för proteinförtunning, peptidseparation och MS-identifiering ligger utanför ramen för denna översyn (Konermann et al., 2011; Masson et al., 2017; Masson et al., 2019).

väte-Deuteriumutbytesmasspektrometristudier av membranproteiner

trots att de delar det växlande åtkomstparadigmet skiljer sig ligandinducerade konformationsförändringar mellan transportörer på grund av skillnader i ligand-protein-interaktioner. Till exempel kan symporters (samtransport av två eller flera ligander) övergå mellan IF och av stater utan bundna ligander, medan ligandbindning är obligatorisk för byte mellan IF och av stater i antiporters (utbyte av ligander på motsatta sidor av membranet) (Forrest et al., 2011; Drew och Boudker, 2016; Bai et al., 2017).

i allmänhet är det svårt att upptäcka lokala ligandinducerade dynamiska förändringar i proteiner. Till exempel är kristallstrukturerna av membranproteiner i både ligandfria och ligandbundna former ofta otillgängliga, vilket utesluter detektering av ligandinducerade konformationsförändringar även för proteiner med kända strukturer. Dessutom kan strukturella snapshots med hög upplösning av apo och ligandbundna tillstånd inte lösa signifikanta konformationsskillnader. Små ligandinducerade konformationsförändringar kan emellertid detekteras med användning av HDX-MS vid specifika proteinunderdomäner under nativa förhållanden genom att mäta differentiellt DEUTERIUMUPPTAG (ASKORHDX) i närvaro och frånvaro av ligander. Denna förmåga hos HDX-MS ger unika möjligheter att ta itu med de mest utmanande frågorna för att belysa mekanismerna för ligand-protein och protein-protein-interaktioner (Rand et al., 2014; Masson et al., 2019; Redhair et al., 2019), som granskats här för ett antal nyligen studerade transportörproteiner.

Konformationsövergångar som ligger till grund för alternerande åtkomst: Na+ / H + Antiporter

Nha-proteiner reglerar cellulärt pH, och volym genom livets riken (Padan och Landau , 2016). Den huvudsakliga strukturella modellen som används för att studera Nha-orthologer är Escherichia coli NhaA, för vilken en kristallografisk struktur av det inaktiva tillståndet vid surt pH är tillgängligt (Hunte et al., 2005). För att studera nhaas strukturella dynamik under Fysiologiskt pH användes HDX-MS nyligen (Eisinger et al., 2017). Avgörande för de insikter som erhållits i denna studie ger HDX-MS globala dynamiska data, i motsats till metoder baserade på platsspecifik märkning, som endast upptäcker rörelser av fördefinierade proteinregioner.

i denna studie erhölls en exceptionellt hög sekvenstäckning på 88,5% för NhaA i tvättmedel, vilket gav insikter i mekanismen bakom alternerande åtkomst vid ligandbindning. Genom att jämföra HDX-mönstren mellan apo-och substratbunden Nha observerades ett återkommande mönster av HDX-förändring i flera spiraler, där ökat deuteriumupptag i en terminal åtföljdes av minskat deuteriumupptag vid den andra terminalen. Upptaget i mitten av spiralerna var i stort sett oförändrat.

baserat på det observerade mönstret för HDX-förändring, även om det inte direkt tillhandahöll rumslig information, föreslogs att översättning av transmembranhelicesna i förhållande till membranet uppträder, vilket återspeglas i de ömsesidiga HDX-förändringarna som observerats för de två termini inom specifika transmembranhelicesna. Denna modell överensstämmer med den” hissliknande ” mekanismen för alternerande åtkomst, vilket innebär en vertikal översättning av transmembranhelices under transportcykeln (Ryan och Vandenberg, 2016). Sammanfattningsvis gav HDX-MS nya insikter om de strukturella övergångarna som är involverade i alternerande åtkomst, ouppnåeliga av de tidigare upplösta strukturerna i den inaktiva NhaA.

effekt av protein-Lipidinteraktioner på transportörernas Konformationslandskap

de flesta sekundära transportörer tillhör major facilitator superfamily (MFS), som delar en bevarad arkitektur trots deras olika funktioner (Radestock och Forrest, 2011). Även om kristallstrukturerna hos MFS-medlemmar är tillgängliga, de gav lite information om protein-lipidinteraktioner och deras effekt på jämvikten mellan OF Och IF-staterna. Således, Martens et al. kombinerade MD-simuleringar med HDX-MS för att studera effekterna av lipidmiljön på tre väl karakteriserade transportörer: laktospermeas, xylostransportör och glycerol-3-fosfatantiporter (Martens et al., 2018).

först infördes en mutation som är känd för att förskjuta jämvikten mot OF-state vid den extracellulära vestibulen hos alla transportörer (Kumar et al., 2014). Jämförelse av WT och muterade transportörer med användning av HDX-MS avslöjade att metoden detekterar konformationsförändringen, med regioner på den extracellulära vestibulen som tar upp mer Deuterium i mutanterna vs. WT, medan motsatsen inträffar för rester vid den intracellulära vestibulen. Därefter rekonstituerades transportörerna i nanodisker bestående av fosfatidylglycerol, tetraoleylkardiolipin och antingen fosfatidylkolin eller fosfatidyletanolamin. Intressant nog skiftade närvaron av fosfatidyletanolamin jämvikten mot IF-tillståndet. Därefter MD-simuleringar av transportörerna i lipidbilayers identiska med nanodisks sammansättning förutspådde direkta interaktioner mellan den laddade fosfatidyletanolaminhuvudgruppen och ett konserverat cytoplasmiskt nätverk av laddade rester, stabilisering av staten (Doki et al., 2013). Mutation av de laddade resterna avskaffade effekten av fosfatidyletanolamin, vilket starkt antyder att specifika fosfatidyletanolamin-proteininteraktioner kontrollerar transportörernas inneboende jämvikt. Denna studie är ett starkt exempel på att kombinera experimentella och beräkningsmetoder för att identifiera subtila men funktionellt signifikanta protein-lipidinteraktioner.

Helix avlindning under Transport: studier av LeuT

LeuT är en prokaryotisk homolog av neurotransmittorn/Na+ symporters (NSS) – familjen, som inkluderar viktiga läkemedelsmål såsom serotonin -, dopamin-och noradrenalintransportörer (Kristensen et al., 2011). LeuT studerades omfattande och dess kristallografiska strukturer längs transportcykeln är tillgängliga (Focke et al., 2013). Dessa strukturer föreslog att storskaliga strukturella omarrangemang krävs under alternerande åtkomst (Krishnamurthy och Gouaux, 2012). Konformationslandskapet som möjliggör övergången mellan IF och stater förblir emellertid svårfångat och kontroversiellt.

för att studera övergången mellan olika tillstånd undersöktes tvättmedel-solubiliserad LeuT under förhållanden som gynnar IF eller av stater (Merkle et al., 2018). Överraskande visade många peptider, huvudsakligen på transportörens intracellulära sida, EX1-kinetik. Detta är ganska ovanligt i vikta proteiner under inhemska förhållanden och anses återspegla en långlivad utveckling av sekundära strukturelement. Baserat på den rumsliga fördelningen av peptider som uppvisar EX1-kinetik, tillsammans med de tillgängliga kristallografiska strukturerna, föreslogs att specifika spiraler genomgår partiell avveckling under alternerande åtkomst och att dessa konformationsförändringar också bidrar till substratfrisättning. Denna studie belyser den funktionella betydelsen av långsamma (sekunder tidsskala) konformationsförändringar som kan lösas väl med HDX-MS, i motsats till andra experimentella eller beräknings (t.ex. MD) metoder.

väte-Deuteriumutbyte masspektrometri av membranproteiner i Lipid Nanodisker

interaktionerna mellan membranproteiner med omgivande lipider kan dramatiskt modulera deras funktion (Vadas et al., 2017). Faktum är att aktiviteten hos eukaryota NSS-medlemmar beror signifikant på specifika lipidproteininteraktioner som modulerar proteindynamiken och följaktligen substratinteraktioner (Divito och Amara, 2009). Därför Adhikary et al. studerade LeuT rekonstituerad till fosfolipid dubbelskiktsnanodisker (Adhikary et al., 2017). Med hjälp av detta tillvägagångssätt undersöktes LeuT under förhållanden som gynnar IF och konformationer. Jämförelse av HDX-mönstren mellan dessa tillstånd avslöjade specifika förändringar i regioner som tidigare var inblandade i transportcykeln, vilket återspeglade funktionellt signifikanta strukturella förändringar. Intressant nog stödde HDX-MS-data, i överensstämmelse med tidigare biofysiska och beräkningsstudier, en mindre lutningsvinkel för den första transmembranhelixen i IF-konformationen jämfört med den som observerades i kristallstrukturerna. Denna skillnad hänfördes till lipidmiljön, eftersom kristallstrukturen erhölls i tvättmedel med en liten mängd lipid. För att sammanfatta ger HDX-MS en flexibel plattform för att studera membranproteiner i olika hydrofoba miljöer och under förhållanden som gynnar specifika konformationstillstånd, utan behov av platsspecifik märkning.

Joninteraktioner med flera platser: Na+/Ca2 + – växlaren

NCX deltar i cellulär Ca2+ homeostas genom att extrudera Ca2+ från cellerna mot dess elektrokemiska gradient (Blaustein och Lederer, 1999). NCX-utbyten 3Na+: 1ca2+, där Na+ och Ca2 + transporteras i separata steg (Khananshvili, 1990). Överraskande avslöjade kristallstrukturen hos NCX från Methanocaldococcus jannaschii (NCX_Mj) fyra jonbindningsställen, samtidigt upptagna av tre Na+ joner på platser som kallas Sint, Smid, Sext och en Ca2+ Jon på en plats som kallas SCa (Liao et al., 2012). Eftersom detta bindningsläge var inkonsekvent med tidigare studier utfördes MD-simuleringar och jonflödesanalyser av mutanter, vilket tyder på att Na+ – joner upptar Sint, SCa och Sext, medan Ca2+ upptar SCa (Marinelli et al., 2014; Giladi et al., 2016b; Giladi et al., 2017; van Dijk et al., 2018). Således binds NA+ – och Ca2 + – jonerna på ett ömsesidigt uteslutande sätt längs transportcykeln.

för att experimentellt fastställa tilldelningen av jonbindningsställen jämförde vi apo-tillståndet med jonbundna tillstånd av NCX_Mj med HDX-MS (Giladi et al., 2016a; Giladi et al., 2017). Trots låg sekvenstäckning inkluderade vår analys 10 av 12 jonkoordinerande rester. Vi upptäckte en Na + – beroende minskning av deuteriumupptag vid Sint, SCa och Sext, men inte Smid, medan i närvaro av Ca2+ observerades minskningen av deuteriumupptag huvudsakligen vid SCa. Detta överensstämmer med förutsägelserna från MD-simuleringarna och mutationsanalyserna som förutsäger ockupationen av Smid av en vattenmolekyl men inte av Na+ eller Ca2+ i marktillståndet (Marinelli et al., 2014; Giladi et al., 2016a; Giladi et al., 2017; van Dijk et al., 2018). I synnerhet har efterföljande kristallografiska studier validerat våra bindningsställenas uppdrag (Liao et al., 2016). Således bekräftade HDX-MS det jonbindningsläge som föreslagits av beräknings-och funktionsstudierna.

Jonselektivitet för en Li + – transporterande NCX-Mutant

mitokondriell Na+ / Ca2 + – växlare (NCLX) uppvisar exceptionell jonselektivitet och utbyter Ca2+ med antingen Na+ eller Li+, medan NCX inte transporterar Li+ (Palty et al., 2010). Även om den fysiologiska relevansen av denna jonselektivitet förblir förbryllande, är det anmärkningsvärt att 9 (av 12) jonkoordinerande rester i NCLX skiljer sig från de i NCX och andra medlemmar av Ca2+/katjon antiporter superfamilj. För att förstå hur dessa skillnader påverkar jonbindningsigenkänning och transport utförde vi strukturbaserad ersättning av jonkoordinerande rester i NCX_Mj för att imitera nclx-bindningsställena (Refaeli et al., 2016). Påfallande förmedlar den nydesignade konstruktionen (benämnd NCLX_Mj) Na+/Ca2+ och Li+/Ca2+ med jämförbara Km-värden (Refaeli et al., 2016).

därefter försökte vi avgöra om jonbindningsställena i NCLX_Mj påminner om NCX_Mj (Giladi et al., 2019). HDX-MS-analyser av joninducerade konformationsförändringar avslöjade att SCa binder Na+, Li+ eller Ca2+, medan en eller flera ytterligare Na+/Li+ – platser av NCLX_Mj är oförenliga med de ursprungliga Na+ – platserna (Sext och Sint) tilldelade NCX_Mj. Dessa resultat antydde att NCLX_Mj kan transportera joner med en elektroneutral stökiometri av 2na+:1ca2+ eller 2LI+:1ca2+. I överensstämmelse med HDX-MS-data accelererar spänningsklämman Na+/Ca2+ växelkurserna i NCX_Mj-rekonstituerade proteoliposomer (på grund av en stökiometri av 3Na+:1Ca2+), medan den inte har någon märkbar effekt på växelkurserna Na+/Ca2+ eller Li+/Ca2+ i nclx_mj (Giladi et al., 2019).

våra studier har visat nyttan av HDX-MS vid identifiering och validering av bindningsställen i jontransportörer, där relativt små skillnader i de joninducerade SAUDIHDX-signalerna ger viktig information om jonselektivitet och konformationsförändringar som uppstår vid jonbindning vid distinkta platser. I kombination med MD-simuleringar och röntgenkristallografi är HDX-MS särskilt tilltalande för att belysa de strukturella determinanterna för jonselektivitet och joninducerade konformationsförändringar i jontransportsystem innefattande flera jonbindningsställen.

slutsatser

under de senaste decennierna har strukturbiologi enormt bidragit till vår förståelse av membranproteinfunktion, främst genom att tillhandahålla statiska ögonblicksbilder av diskreta tillstånd i hög upplösning. För att fullständigt dechiffrera struktur-funktionsförhållandena bakom den komplexa processen för löst transport, ett växande antal experimentella och beräkningsmetoder har utvecklats för att överbrygga klyftan mellan dessa statiska ögonblicksbilder och bestämma de underliggande konformationslandskapen. HDX-MS används alltmer för att studera intakta membranproteiner under olika nativa förhållanden, vilket ger nya möjligheter att studera membranproteininteraktioner, substratigenkänning och transportrelaterade konformationsövergångar. Framtida utveckling inom instrumentering och dataanalys automation kan tillåta användning av HDX-MS i hög genomströmning, fullt utnyttja dess potentiella användning i grundforskning och biomedicinska tillämpningar såsom läkemedelsdesign.

Författarbidrag

MG och DK granskade litteraturen och skrev manuskriptet.

finansiering

detta arbete stöddes av Israel Science Foundation (Grant #1351/18) (D. K) och av Israel Cancer Research Foundation (Grant #19202) (MG). Ekonomiskt stöd från Shmuel Shalit award till DK är tacksamt erkänt.

intressekonflikt

författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.