gränser i mikrobiologi

värdspecifik interaktion mellan Rhizobium och Växtpartners

bakterierna som bildar kvävefixerande symbios med baljväxtväxter som tillhör olika grupper av sackaros-och tuberkulosproteobakterier kallas kollektivt rhizobia (Chen et al., 2003; MacLean et al., 2007). Många av de Proteobakterier är engagerade i långsiktiga interaktioner med högre eukaryoter. Dessa interaktioner sträcker sig från ytkolonisering genom fakultativa symbiotiska förhållanden för att förplikta intracellulär patogen eller endosymbiont livsstil. De symbiotiska gener som krävs för nodulbildning, värdcellinfektion och kvävefixering har förvärvats genom lateral genöverföring som är den primära källan till genetisk mångfald av rhizobia. Därför kan rhizobia vara närmare besläktad med patogener (såsom Agrobacterium eller Brucella) än till varandra. Rhizobia tenderar att ha stora genom (upp till 10.5 Mbp) som i snabbväxande rhizobia sprids på flera replikoner (MacLean et al., 2007). Till exempel har Sinorhizobium meliloti, endosymbionten av Medicago-arter, ett tri-delat genom; en 3,65 Mbp-kromosom och två megaplasmider, pSymA och pSymB (1,35 och 1,68 Mbp) som båda är oumbärliga och bär majoriteten av symbiotiska gener. Emellertid innehåller många S. meliloti-stammar ytterligare hjälpmedelstora plasmider och sålunda kan S. meliloti-genomet innehålla upp till 9000 gener (Barnett et al., 2001; Capela et al., 2001). I motsats till rhizobia har obligatoriska endosymbionter av insekter vanligtvis ett starkt reducerat (160-450 Kbp) genom som säkerställer deras multiplikation och koder för några specifika biosyntetiska vägar inklusive de som uppfyller värdens behov (Moran et al., 2008; Price et al., 2011). Dessa otroligt reducerade genom förstärks ändå och kompenserar det minskade genomet med ett polyploid DNA-innehåll.

rhizobias växtpartners tillhör familjen Leguminosae / Fabaceae. Kvävefixerande symbios har utvecklats i flera linjer, men inte alla baljväxter bildar symbios. Hittills är 12 000 nodulerade baljväxtarter kända och var och en har sin egen Rhizobiumpartner(er). Symbiosen utlöses av kvävehushållning av värdväxten som måste välja sin Rhizobiumpartner från miljarder bakterier i rhizosfären. Detta uppnås genom utsöndring av flavonoidsignalmolekyler från roten som fungerar som kemoattraktiva men viktigast som inducerare av Rhizobium noduleringsgenerna (Oldroyd, 2013). Dessa gener krävs för produktion av bakteriella signalmolekyler; Nodfaktorerna (NFs) som utlöser nodulutvecklingsprogrammet i värdväxten (Walker och Downie, 2000). NFs är lipochitooligosackaridmolekyler som bär värdspecifika substitutioner på de terminala sockerresterna och karakteristiska lipidkedjor, som känns igen av Värdreceptorer av LysM-typ och krävs både för nodulutveckling och bakteriell infektion. Intressant är att den antika symbiosen av landväxter med arbuscular mycorrhizal (AM) svampar fungerar med liknande lipochitooligosackaridsignalmolekyler, Myc-faktorerna som uppfattas av liknande men olika lysm-typreceptorer som NFs (Abdel-Lateif et al., 2012; Oldroyd, 2013). Myc-faktorerna och NFs aktiverar en gemensam signalväg men efter involveringen av de vanliga symbiotiska generna som konserveras i växter avviker vägarna; en som leder till nodulering, den andra för AM-symbios.

Växtinfektion och nodulbildning är invecklade processer; Nodfaktorer spelar olika roller i nodulorganogenes och rothårinfektion. Dessutom, förutom Nodfaktorer, är olika bakteriella ytpolysackarider avgörande för effektiv infektion (Fraysse et al., 2003). I de flesta baljväxter kommer rhizobia in i värden via rothåren där genom invagination av plasmamembranet bildas en infektionstråd (IT) som innehåller de multiplicerande bakterierna och växer mot rotbarken. Ett mindre frekvent och gammalt infektionssätt sker via sprickor på rotytan hos vissa baljväxter.

bestämd och obestämd Nodulutveckling

Nodulutveckling kräver mitotisk reaktivering av kortikala celler som leder till nodulär primordiumbildning som sedan differentierar till kvävefixerande rotknutor som ger mikroaerobiskt tillstånd i den centrala zonen för funktion av det syrekänsliga kväveasenzymet i bakterioiderna. Beroende på den övergående och ihållande naturen hos värdcellsproliferation kan nodulerna vara antingen bestämda eller obestämda typ (Terpolilli et al., 2012; Kondorosi et al., 2013). Bestämda knölar har ingen meristem och innehåller homogen population av symbiotiska celler. Bestämda knölar utvecklas till exempel på Phaseolus vulgaris och Lotus japonicus rötter.

tvärtom upprätthålls den aktiva celldelningen i de obestämda nodulerna. En nodulär meristem är närvarande i den apikala regionen (zon I) som genom konstant generering av nya celler framkallar kontinuerlig tillväxt och långsträckt nodulär form. Cellerna som lämnar meristemet delar sig inte längre och går in i en differentieringsfas. Infektionstråden frigör bakterierna i de submeristematiska cellerna, som differentierar gradvis längs 12-15-cellskikten i infektionszonen (zon II), vilket leder till utveckling av kvävefixerande symbiotiska celler i nodulzon III (Figur 1; Franssen et al., 1992). Medicago sativa, M. truncatula, Vicia sativa och Pisum sativum är exempel på växter som bildar obestämda knölar.

tillväxt av symbiotiska celler involverar förstärkning av värdgenomet genom Endoredupliceringscykler

Extrem växtcellförstoring kan observeras i både de bestämda och obestämda nodulerna. Cytoplasman hos en kvävefixerande symbiotisk cell är värd för cirka 50 000 bakterier. För att rymma ett så stort antal endosymbionter växer värdcellerna. I M. truncatula noduler är volymen av kvävefixerande celler 80 gånger större än den för de diploida meristematiska cellerna. Tillväxten av infekterade celler sker stegvis i zon II och är konsekvensen av upprepad endoreduplicering (ER) av genomet utan mitos. I zon II är cellcykelmaskineriet fortfarande aktivt men bristen på mitotiska cykliner hämmar mitos och omvandlar de mitotiska cyklerna till endoredupliceringscykler (Cebolla et al., 1999). Detta uppnås genom cellcykelomkopplaren CCS52A-protein som genom förstörelsen av de mitotiska cyklinerna inducerar upprepade omgångar av genomduplikation som leder till bildandet av gradvis växande polyploida celler (Roudier et al., 2003; Kondorosi och Kondorosi, 2004). I Medicago-arter kan ploidi-nivåerna nå 64C som representerar 64-faldigt högre DNA-innehåll jämfört med haploida celler (C motsvarar haploid DNA-innehåll; Vinardell et al., 2003). Nedreglering av CCS52A i M. truncatula hade ingen effekt på primordiumbildning men var skadlig för noduldifferentiering vilket indikerar att er-cyklerna och bildandet av stora högpolyploida celler är väsentliga för nodulfunktion (Vinardell et al., 2003). Intressant är att kortikala celler som innehåller am-svampar också är polyploida, liksom de nematodmatande jätterotcellerna (Favery et al., 2002; Genre et al., 2008). På liknande sätt är insektssymbiotiska celler, bakteriocyterna som har intracellulära endosymbionter också stora och polyploida (Nakabachi et al., 2010). I angiospermväxter är polyploidi frekvent och det specifika ärvda mönstret av polyploidi i olika organ, vävnader och celltyper tyder på att det kan vara en viktig källa till värdcellernas specialiserade fysiologi (Nagl, 1976; Edgar et al., 2014). Förutom celltillväxt kan de multipla genkopiorna, brist på kromosomkondensation bidra till högre transkriptionella och metaboliska aktiviteter. Associering av polyploidi med olika cellfunktioner antyder emellertid en inverkan av polyploidi också på nukleosomernas arkitektur och på epigenomet som styr aktivering eller förtryck av specifika genomiska regioner. Följaktligen verkar det polyploida genominnehållet i symbiotiska celler vara en förutsättning för noduldifferentiering och för uttryck av de flesta symbiotiska värdgener (Maunoury et al., 2010).

olika öden för kvävefixerande bakterier

bakterierna som frigörs från IT finns i värdcytoplasman som organellliknande strukturer, kallade symbiosomer. Bakterierna har ingen direkt kontakt med cytoplasma eftersom de omges av ett peribacteroidmembran, även känt som symbiosommembran (SM). Bakterioiden, SM och utrymmet mellan dem innefattar symbiosomen (Catalano et al., 2004). SM under dess bildning återspeglar dess plasmamembran ursprung, senare modifieringar av dess sammansättning öppnar nya, specialiserade roller vid värd-endosymbiont-gränssnittet (Limpens et al., 2009; Ivanov et al., 2012; Brear et al., 2013; Sinharoy et al., 2013). Bakterioiderna multiplicerar i de växande värdnodulcellerna till en viss celldensitet, anpassar sig till endosymbiotiska livsstilar och mikroaerobiska förhållanden och mognar till kvävefixerande bakterier. Bakteriernas form och fysiologi kan dock vara påfallande olika i de olika baljväxterna. I vissa baljväxtvärdar har kvävefixerande bakterier samma morfologi som odlade celler; denna typ av bakterier kan återgå till den fritt levande formen. I andra föreningar omvandlas bakterioiderna irreversibelt till polyploida, förstorade, icke-odlingsbara endosymbionter. Dessa terminalt differentierade bakterier kan vara långsträckta och till och med grenade och 5 – till 10-faldigt längre än de fritt levande cellerna eller kan vara sfäriska från 8 till minst 20-faldigt förstärkt genom beroende på värden (Mergaert et al., 2006; Nakabachi et al., 2010). Terminal differentiering av bakterier är värdstyrd, utvecklad i flera grenar av Leguminosae-familjen som indikerar värdfördel och sannolikt högre symbiotisk prestanda (Oono et al., 2010). Terminal bacteroiddifferentiering är den bästa belysta i S. meliloti – M. truncatula symbios. I M. truncatula noduler, de mest synliga händelserna av terminal bacteroiddifferentiering förekommer i zon II. multiplikation av bacteroids stannar i mitten av zon II där cellförlängning och enhetlig förstärkning av flera replikoner genom endoredupliceringscykler börjar. Längs 2-3 cellskikt vid gränsen till zon II och III (kallad interzon) plötslig tillväxt av bakterier är synlig och når praktiskt taget sin slutliga storlek, men kvävefixering sker endast i zon III.

Värdpeptider styr Bakteroiddifferentiering

jämförelse av nodultranskriptomer av baljväxter med reversibel och irreversibel bakteroiddifferentiering avslöjade förekomsten av flera hundra små gener som endast var närvarande i genomet hos de värdväxter där bakteroiddifferentiering var terminal. I M. truncatula producerar nodulcellerna minst 600 nodulspecifika symbiotiska peptider (symPEPs). SymPEP-generna aktiveras endast i S. meliloti-infekterade polyploida symbiotiska celler (Kevei et al., 2002; Mergaert et al., 2003), men vissa uppsättningar vid det tidigare, andra under de senare stadierna av nodulutveckling. En stor del, mer än 500 gener kodar nodulspecifika cysteinrika (NCR) peptider (Mergaert et al., 2003; Alunni et al., 2007; Nallu et al., 2014). NCR-peptiderna är riktade mot bakteroiderna och när deras leverans till endosymbionterna blockerades avskaffades bakteroiddifferentiering vilket visar att peptiderna är ansvariga för terminal differentiering av S. meliloti-bakterier (Van de Velde et al., 2010). Den höga sekvensvariationen och de karakteristiska uttrycksmönstren för NCR-gener föreslår mångfald i deras funktioner, verkningssätt och bakteriemål vid olika stadier av bakteroidmognad (Figur 2). Men varför producerar värdcellen en arsenal av NCRs? Vad kan vara fördelen med en så mångsidig peptidrepertoar? Är det nödvändigt för värdens interaktion med olika bakterier? De symbiotiska partnerna till M. truncatula är S. meliloti och S. medicae, men i jorden finns det otaliga stamvarianter av båda arterna. M. truncatula representeras också av många olika ekotyper och anslutningar som skiljer sig åt i antal, sekvenser och uttrycksprofil för NCR-gener och i deras symbiotiska interaktioner med olika S. meliloti-och S. medicae-stammar (Nallu et al., 2014; Roux et al., 2014). Medan en nodul innehåller en enda bakterietyp, kan de olika nodulerna på samma rotsystem ha distinkta bakteriepopulationer. Det är möjligt att växten som känner igen de olika endosymbionerna manipulerar dem med en stamspecifik repertoar av peptider. Dessa skillnader kan lägga till en ytterligare kontrollnivå för värd-symbiont-specificitet och därmed för noduleringseffektivitet.

även om symPEPs representerar unika peptidklasser, liknar deras strukturer antimikrobiella peptider (ampere). Ampere med brett spektrum av mikrobiell celldödande aktivitet är oftast katjonisk provokerande celldöd genom porbildning, membranstörning och därmed lys av mikrobiella celler. Det faktum att celldelningsförmågan definitivt förloras under endosymbiontdifferentiering indikerar att åtminstone vissa symPEPs har antimikrobiella aktiviteter. Behandling av bakterier med syntetiska katjoniska NCRs provocerade faktiskt snabb och effektiv dosberoende eliminering av olika gramnegativa och grampositiva bakterier inklusive viktiga humana och växtpatogener (Van de Velde et al., 2010; Tiricz et al., 2013). Denna ex-planta-dödande effekt korrelerad med permeabilisering av mikrobiella membran, men symPEPs i deras naturliga miljö – i nodulcellerna – genomtränger inte bakteriemembranen och dödar inte endosymbionerna. Mest sannolikt är peptidkoncentrationerna i nodulerna signifikant lägre än de som appliceras i in vitro-analyserna. Dessutom produceras katjoniska peptider tillsammans med anjoniska och neutrala peptider i samma cell, och möjlig kombination av några tiotals eller hundratals peptider med olika laddning och hydrofobicitet kan neutralisera den direkta bakteriedödande effekten av de katjoniska peptiderna.

involveringen av ampere eller AMP-liknande peptider är inte unik för Rhizobium-legume symbios. I weevil Sitophilus producerar de symbiotiska cellerna den antimikrobiella peptiden coleoptericin-A (ColA) som framkallar utvecklingen av jätte filamentösa endosymbionter genom att hämma celldelning och skyddar de närliggande insektsvävnaderna från bakteriell invasion (Login et al., 2011). I detta system är en enda peptid tillräcklig för differentiering av den obligatoriska vertikalt överförda endosymbiont till skillnad från noduler som arbetar med hundratals symPEPs och kan vara värd för otaliga stamvarianter som deras endosymbionter. I aphid-Buchnera-symbiosen producerar värdcellerna också bakteriocytspecifika peptider inklusive cysteinrika peptider (BCR) som liknar Medicago NCR-peptiderna, men funktionerna hos dessa symbiotiska peptider har inte rapporterats ännu (Shigenobu och Stern, 2013).

NCR247: ett exempel för multi-Target Host Effector

transkriptomanalys av M. truncatula noduler i olika stadier av deras utveckling, lasermikrodissektion av nodulregioner, in situ hybridisering, immunolokalisering av utvalda peptider och symPEP promotor-reporter-genfusioner i transgena noduler möjliggör kartläggning av verkan av enskilda peptider i symbiotiska celler från tidig infektion till sent kvävefixeringstillstånd. NCR247 uttrycks i de äldre cellskikten i zon II och i interzonen där bakteriell celldelning stannar och anmärkningsvärd förlängning av endosymbionterna uppträder (Farkas et al., 2014). Denna lilla katjoniska peptid dödade effektivt olika mikrober in vitro och in silico-analysen indikerade dess extrema proteinbindningsförmåga. FITC-märkt NCR247 gick in i bakteriecytosolen där dess interaktioner med många bakterieproteiner var möjliga. Bindningspartners identifierades genom behandling av S. meliloti-bakterier eller bakterier med StrepII/FLAGGMÄRKTA peptider följt av affinitetskromatografi och identifiering av interagerande partners med LC-MS/MS och västerländsk analys (Farkas et al., 2014).

en av interaktorerna var FtsZ – celldelningsproteinet som spelade en avgörande primär roll i celldelning. Ett antal antibiotiska peptider är kända för att utöva bakteriedödande eller bakteriostatisk effekt genom interaktionen med FtsZ, vilket hämmar dess polymerisation och därigenom hindrar korrekt Z-ring och septumbildning (Handler et al., 2008). NCR247 samrenades med FtsZ från bakteriell cytoplasma och visade sig störa septumbildning. NCR035 uppvisar in vitro också bakteriedödande effekt och produceras i samma symbiotiska celler som NCR247 ackumuleras vid division septum som indikerar samtidig eller på varandra följande verkan av dessa peptider och utveckling av flera värdstrategier för att hämma endosymbiontproliferation. En annan studie visade att uttryck av viktiga celldelningsgener, inklusive gener som krävs för Z-ringfunktion, dämpades starkt i celler behandlade av NCR247 (Penterman et al., 2014). Förbehandling av bakterier med subletala ncr247-koncentrationer avskaffade lokalisering av FITC-NCR035 till septum och provocerad cellförlängning (Farkas et al., 2014).

ribosomala proteiner var de vanligaste ncr247-interagerande partnerna. NCR247 observerades starkt hämma bakteriell proteinsyntes på ett dosberoende sätt både in vivo och in vitro (Farkas et al., 2014). Dessa resultat antydde att ett läge för ncr247-peptidverkan binder till ribosomerna både i bakterieceller och bakteroider. Intressant nog observerades ett förändrat mönster och minskad komplexitet hos de interagerande proteinerna i bakterioiderna. Följaktligen var den allmänna expressionsnivån för ribosomala proteiner i genomsnitt 20 gånger lägre i bakterioiderna än i de fritt levande cellerna med olika relativa överflöd av transkript av enskilda ribosomala proteiner. Ribosomdiversifiering i bakterier kan ha en betydande roll genom att bidra till den avancerade översättningen av specifika proteiner och därigenom stödja den specialiserade, energikrävande fysiologin av mycket riklig kvävefixeringsfunktion.

GroEL chaperon var också en direkt samverkande partner till NCR247 (Farkas et al., 2014). Av de 5 GroEL-proteinerna är GroEL1 eller GroEL2 tillräcklig för överlevnad medan GroEL1 uttryckt på hög nivå i nodulen är avgörande för symbios (Bittner et al., 2007). Det behövs för fullständig aktivering av noduleringsgenerna och montering av kväveas-komplexet. GroEL har extrem funktionell mångsidighet genom att interagera med hundratals proteiner. Ncr247-GroEL1-interaktionen kan få konsekvenser direkt på GroEL men indirekt också på Groelsubstraten och tillhörande biologiska processer. Frånvaro av GroEL1 allvarligt påverkad bakteriell infektion och underhåll och differentiering av bakterier som visar ett allmänt behov av GroEL1 i alla stadier av kvävefixeringsnodulutveckling.

involveringen av GroEL-och värdpeptider i mikrobe-värdinteraktioner är inte unik för Rhizobium-legume symbios. I weevil samverkar symbiotiska celler coleoptericin-a (ColA) också med GroEL (Login et al., 2011). GroEL spelar också en viktig roll i underhållet av endosymbionter (Moran, 1996; Kupper et al., 2014). Eftersom de flesta symbiotiska system ännu är outforskade och genomiska och proteomiska verktyg med hög genomströmning är bara nyligen tillgängliga, kan vi bara förutsäga att värdpeptider-medierad endosymbiontdifferentiering, likaså genomförstärkning av värdceller och terminalt differentierade endosymbionter är allmänna strategier för symbios.

slutsats

symbiotiska och patogena bakterier använder liknande metoder för att interagera med sina värdar och att överleva inom värdceller, även om resultaten av dessa interaktioner är påfallande olika. Växter och djur kan generera medfödda immunsvar mot mikroorganismer vid uppfattningen av MAMPs (mikroorganismassocierade molekylära mönster). Denna uppfattning resulterar i aktivering av signalkaskader och produktion av antimikrobiella effektorer. AMP-liknande värdpeptider såsom M. truncatula NCR-peptider eller Weevil ColA antimikrobiell peptid spelar viktiga och mångfacetterade roller för att kontrollera multiplikationen och differentieringen av endosymbionter, vilket begränsar närvaron av bakterier till de symbiotiska cellerna. Således använder värdorganismer dessa effektorpeptider för att tämja och till och med anställa utvalda mikrobiella invaderare för service.

intressekonflikt uttalande

författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.

erkännanden

arbetet i våra laboratorier stöds av Europeiska forskningsrådets” SYM-BIOTICS ” avancerade bidrag till Chubbiva Kondorosi (bidragsnummer 269067) och av T USBI-4.2.2.A-11/1 / KONV-2012-0035 stöds av Europeiska unionen och samfinansieras av Europeiska socialfonden.