experimentell
märkning av RuBisCo:
Aedans(454): donator F(58): acceptor
bindande studier:
villkor:
ADP bullet: GroEL komplex bunden till GroES och ADP
ApoGroEL: bara GroEL comlex (används i tidigare bindningsstudier av rubisco-substrat)
Lin et al.
1. Det var en skillnad i FRET vid substratbindning till transringen av ADP-kula vs. apogroelring.
– Detta var uppenbart genom släckning av donatorfluorescens (B.)
– detta indikerade en skillnad i konformation av proteinsubstratet.
 |
 |
2. Hittade en” passiv ” utfällning av substratproteiner bundna till apogroelring.
– men denna utveckling inträffade mycket långsammare än Groels funktionella reaktionscykel.
3. Det finns mindre ”passiv” utfällning av substratet bundet till ADP bullet trans-ring.
– bekräftade detta med proteas digestionsstudier.
– Detta är dock det mer fysiologiskt relevanta komplexet.
– så är detta en maximalt effektiv nivå, eller bara det första steget i reaktionscykeln?
för att testa den fysiologiska relevansen lade de ATP till ADP-Kulreaktionen och övervakade FRET
 |
vid tillsats av ATP fann de: – en initial snabb, forcerad konformationsexpansion av substratet – och sedan en långsammare komprimeringsfas – uppenbar i Figur b |
 |
 |
-figur C indikerar att komprimeringsfasens kinetik är beroende av groes koncentration, vilket betyder att den är beroende av komplexets questreringsmekanism.
– medan expansionsfasen är oberoende av GroES koncentration.
slutsatsen att det finns två faser av Utfällning:
– långsam passiv Utfällning på grund av substratbindning till transring av Groelkammaren(från första bindningsexperimentet)
– snabb, ATP-driven Utfällning på grund av konformationsförändringen av Groelkammaren.
snabb Utfällning är inte GroES beroende:
– ett överskott av en enda ringad GroEL variant, SR1 användes som en GroES fälla.
– SR1 kan inte binda substrat och katalysera en utvecklande reaktion,men kan binda och sekvestrera GroES för att bestämma beroendet av reaktionen på sekvestrering av substratet.
– de bestämde att den snabba utvecklingen övervakad av FRET inträffade utan GroES cap närvarande, och den efterföljande komprimeringsfasen gjorde det inte.
– Detta indikerar att den snabba expansionsfasen är beroende av konformationsförändring av GroEL inducerad av ATP-bindning.
så .. är utfällningen av substratet nödvändigt för produktiv vikning?
– är detta ett viktigt steg, och viktigt att GroEL/GroES fällmekanism?
– de fann att fraktionen av icke-infödda RuBisCo som framträder idet ursprungliga tillståndet är proportionellt mot omfattningen av utvecklingen.
– för att undersöka detta ville de mäta den långsamma, passiva utfällningen av substratet på grund av Groelbindning ensam(inte ATP
beroende)
– de utnyttjade igen SR1-bindning till substrat, den här gången inte som atrap, utan som en passiv utfällbar bindningsplats för substratet.
– inkubationstid med SR1 är korrelerad med mängden utfällning, eftersom utfällningen endast beror på bindning av substratet.
– de bestämde att det finns en korrelation mellan mängden utfällning till nativt protein.
– så den tvingade utvecklingen av GroEL / GroES är ett effektivt sätt att främja utfällningsmekanismen
som behövs för korrekt proteinvikning.
 |
 |
 |
 |