handlingsmekanismer för Du-Huo-Ji-Sheng-Tang på brosknedbrytning i en Kaninmodell av artros

Abstrakt

Du-Huo-Ji-Sheng-Tang (DHJST) är en traditionell kinesisk örtmedicin som används för att behandla artros. I den aktuella studien undersöktes den terapeutiska effekten av DHJST på brosknedbrytning i en kaninmodell av artros. I knäleden hos kaniner utfördes främre korsbandstransektion (ACLT) för att inducera experimentell artros. I slutet av den sjätte veckan delades 30 kaniner med ACLT i sex grupper, kontrollgrupp, DHJST-grupp och osaminetacine (OSA) – grupp, som följdes i ytterligare 4 veckor. De andra tre grupperna av kaniner med ACLT var obehandlade med DHJST eller OSA, som offrades efter 6 veckor och fungerade som 6 veckors tidskontroller. Resultaten visade att i slutet av den sjätte veckan efter operationen var det en signifikant histologisk degeneration i kontrollgruppen jämfört med den normala gruppen. I kontrollgruppen var medelvärdet för histologisk degeneration ytterligare ökningar vid 10: e veckan, och det fanns en signifikant lägre medelvärde för histologisk degeneration i DHJST-gruppen jämfört med kontrollgruppen. För att undersöka den potentiella mekanismen detekterades expressionsnivån för VEGF och HIF-1 kg. Uttrycket av VEGF mRNA och HIF-1 mRNA är låga i normal grupp, medan aktiviteterna ökar gradvis i kontrollgruppen. Jämfört med samma tidpunktsmodellgrupp minskade dock aktiviteten för VEGF och HIF-1 kg i DHJST-gruppen. Sammanfattningsvis utövar DHJST signifikant terapeutisk effekt på artroskaniner, och mekanismer är associerade med inhibering av VEGF och HIF-1-expression.

1. Introduktion

artros (OA) är en progressiv och försvagande sjukdom som kan ta år att kliniskt manifestera hos drabbade individer. Bruskåldring och kondrocytåldring spelar en viktig roll i patogenesen och utvecklingen av OA. Under utvecklingen av OA är det ofta en fokal ökning av celldöd. Massor av rapporter avslöjade att kondrocyt senescens bidrar till risken för broskdegenerering genom att minska kondrocyternas förmåga att underhålla och reparera ledbroskvävnaden . Eftersom det teoretiseras att varje kondrocyt är ansvarig för underhållet av den extracellulära matrisen som omger den, och att matrismolekyler som produceras i en region i vävnaden har en mycket begränsad förmåga att korsa vävnaden, kan fokalförlusten av livskraftiga celler vara delvis ansvarig för vävnadens oförmåga att reparera mindre skador .

För närvarande finns det inget botemedel mot OA, och tillgängliga behandlingar saktar bara sjukdomsprogressionen . Under de senaste 20 åren har traditionell kinesisk medicin (TCM) sett betydande framsteg mot OA, såsom att förbättra patienternas kliniska fynd, hämma inflammatorisk reaktion och broskdegenerering . In vivo och in vitro-studie visade också att kinesiska örter formel är av flera omfattande åtgärder mot OA . Du-Huo-Ji-Sheng-Tang, som består av Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi och Poria, har använts i stor utsträckning för behandling av OA. Det kan förbättra kliniska symtom, knäfunktion och livskvalitet för patienter . Baserat på vår kunskap om OA-patogenes i TCM undersökte vi effekten av DHJST på att förhindra broskdegenerering av OA hos kaniner och observerade dess mekanismer.

2. Metoder

2.1. Material

den återvändsgränd colorimetric apoptosis detection system (TUNEL analys) erhölls från Nanjing Jiancheng biotech Company (Kina). Trizol Total RNA extraktion kit, DNA molekylär markör, SYBR Premix EX TaqTM och perfekt realtid kit köptes från Invitrogen Co. (USA). Örter i DJST (bestående av Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi och Poria, som tillhandahålls av Shanghai Huayu Chinese Herbs Co. Ltd., Kina) ackrediterades av en farmakognosist enligt standardprotokoll, utarbetade av Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, blandades komponenterna i ordning med förhållandet mellan 2 : 1 : 1 : 1 : 0.2 : 1 : 0.3 : 1 (torrvikt) extraherades läkemedlen med standardmetoder enligt Chinese Pharmacopoeia (China Pharmacopoeia and Committee, 2000). Dessa råa läkemedel blöts i destillerat vatten och kokades i 30 minuter två gånger, och läkemedelslösningen filtrerades genom ett nät, därefter koncentrerades filtratet till 4 g mL−1 av en vakuumpump och lagrades sedan vid -20 kcal C tills användning. Osaminetacin (OSA), varje tablett innehåller 25 mg indometacin och 75 mg aminoglukos (levererad av Hebei Jizhong Pharmaceutical Co. Ltd., Kina), användes som positiv kontrollmedicin.

2.2. Kaniner och Vävnadsberedning

fyrtioåtta månader gamla Nya Zeelands vita kaniner levererades av Experimental Animal Center till Chinese Academy of Science. Trettio kaniner genomgick ensidig främre korsbandstransektion (ACLT) under generell anestesi. De normala kaninerna genomgick inte ett förfarande.

i slutet av den sjätte veckan delades de 30 kaninerna med ACLT i sex grupper, kontrollgrupp, DHJST-grupp och OSA-grupp, som följdes i ytterligare 4 veckor. De andra tre grupperna av kaniner med ACLT var obehandlade med DHJST eller OSA, som offrades efter 6 veckor och fungerade som 6 veckors tidskontroller. Dekoktionerna administrerades oralt vid Dosering 0.923 g (kg−1·d−1) under 4 veckor administrerades kaniner i osa−gruppen OSA 0,09 g (kg−1·d-1) under en period av 4 veckor, modellkontrollgrupp och normal grupp administrerades oralt med samma volym fysiologisk saltlösning.

kaniner offrades för provtagning. Protokollet fick godkännande av utskottet för djurförsök vid University Medical Center, Shanghai, Kina. Kanin tibiae avlägsnades och tibia ledbrosk lagrades omedelbart vid -80 kcal C. Tibiae dissekerades noggrant och rensades från intilliggande muskel och fixerades omedelbart i 10% formalin i 24 timmar. Tibiae avkalkades därefter i 4 veckor i 100 g/L etylendiamintetraättiksyra, tvättades i PBS, dehydratiserades genom en serie etanol och inbäddades i paraffin på ett standardiserat sätt för att säkerställa korrekt orientering. Paraffinvävnadssektioner (7 occurm) skars på ett standardiserat sätt. Sektioner deparaffiniserades för histokemiska analyser.

2.3. Histologisk bedömning av brosk

histologisk bedömning utfördes på femorotibiala leder av kaniner i DHJST-gruppen, OSA-gruppen och kontrollgrupperna. Sektionerna färgades med Safranin O-fast green. Dessa histologiska sektioner från varje plats utvärderades med hjälp av ett modifierat Mankin-klassificeringssystem (Tabell 1) av två oberoende, styrelsecertifierade veterinärpatologer.

2.4. TUNEL-analys

H2O2-inducerad apoptos detekterades genom att utföra terminal deoxynukleotidedyltransferas-medierad dutp nick end-labelling (TUNEL)-analys med användning av ett Apo-DirectTM-Kit (CalBiochem, San Diego, CA). TUNEL utfördes enligt tillverkarens instruktioner. Kort efter förbehandling och exponering för H2O2 skördades celler, tvättades, fixerades, permeabiliserades och märktes för DNA-strängbrott och analyserades sedan på en Coulter Epics Elite flow cytometer (Beckman-Coulter, Miami, USA). Alla analyser utfördes i tre exemplar.

2,5. Fluorescerande kvantitativ PCR

totalt RNA extraherades från 50 mg brosk i tibiae articular med användning av Trizolreagens. Syntes av cDNA utfördes med användning av 4 occurg av totalt RNA per prov med slumpmässiga primers och reagenser som ingår i Revert Aid första strängen cDNA synthesis kit. Två mikro liter (2 occl) av varje prov användes för realtids-PCR i ett Rotor-Gen 2000-system (Australien). Relativ kvantifiering beräknades med hjälp av delta cycle threshold () relativ kvantifiering. Tröskelcykeln () för den endogena kontrollen CAPDH mRNA och målsignalerna bestämdes och den relativa RNA-kvantifieringen beräknades med användning av jämförande metod där

sekvenser av primrar som används för vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) är: 5′-TGCCCACCGAGGAGTTCA-3(framåt) och 5′-GGCCCTGGTGGGGTTGAT-3(omvänd) (Produktlängd: 75 bp).Sekvenser av primers som används för hypoxi-inducerbar faktor-1 kg (HIF-1 kg) är: 5 ’- CAGTGCAAAAGACAGGTGGAAG-3(framåt) och 5’-ccctgtatggtggtgatgttgt-3 (omvänd) (Produktlängd: 107 bp).Sekvenser av primers som används för GAPDH är: 5 ’-CCGAGGGCCCACTAAAGG-3(framåt) och 5’-GCTGTTGAAGTCACAGGAGACAA-3(omvänd) (Produktlängd: 88 bp).

2.6. Statistisk analys

alla resultat uttrycktes som medel-och standardavvikelse (SD). Mätdata analyserades med hjälp av en enkelriktad analys av varianser (ANOVA, SPSS 11.0). Rangdata analyserades med ridit. Resultatet av P < .05 ansågs vara statistiskt signifikant.

3. Resultat

3.1. ACLT-inducerad histologisk Degeneration hos kaniner reducerades med DHJST

representativa histologiska sektioner visas i Figur 1. I slutet av 10: e veckan observerade vi en normal integritet hos ledytan i normal grupp (Figur 1(a)). I kontrollgruppen, med ökad degeneration, var det en förlust av Safranin O-snabb grön färgning som åtföljde klyftbildning som sträckte sig in i mitten och djupa zoner (Figur 1(B)), och i DHJST-gruppen förlorades det med tidig mild fibrillering och en förlust av Safranin O-snabb grön färgning observerades tillsammans med kondrocytklustring (Figur 1(c)). OSA-gruppen, med förlust av Safranin o-fast grön färgning, liknade dessa förändringar DHJST-gruppen(Figur 1 (d)). I slutet av den sjätte veckan efter operationen var det en signifikant histologisk skillnad i kontrollgruppen jämfört med den normala gruppen (P < .01). I kontrollgruppen var medelvärdet för Safranin O-fast grön färgning ytterligare ökningar vid 10: e veckan jämfört med den vid den 6: e veckan (P < .01) (Figur 2 a). Vid 10: e helgen var det signifikanta skillnader i Mankin-poäng mellan kontrollgruppen och DHJST-gruppen, det var en signifikant lägre Medelpoäng för Safranin O-fast grön färgning i DHJST-gruppen jämfört med kontrollgruppen (P < .01) (Figur 2 (b)) och inga statistiskt signifikanta skillnader i Mankin-poängen mellan DHJST-gruppen och OSA-gruppen (P >.05).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 1

Histological examination of cartilage (Safranin O-fast green staining, ×100).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 2

The influence of DHJST on histological parameters and apoptotic of chondrocytes. Resultaten presenterades som medel för SD (n = 5 per grupp) i varje kolumn. * P < .01 kontra kontrollgruppen för artros vid den 6: e veckan, **P < .01, jämfört med de i kontrollgruppen för artros.

3.2. DHJST hämmade broskceller apoptos

i slutet av den sjätte veckan efter operationen, index för apoptos cell i kontrollgruppen jämfört med den i den normala gruppen var signifikant skillnader (P < .01). I kontrollgruppen ökades indexet för apoptoscellen fortfarande kraftigt (från medelvärde av SD 0,35 0,13 0,13 i den sjätte veckan till 0,62 0,10 0,10 i den 10: e veckan; P < .01) (Figur 2 c). I slutet av 10: e veckan, jämfört med DHJST-gruppen, ökar indexet för apoptoscell anmärkningsvärt i kontrollgruppen (P < .01) (Figur 2 d). Det fanns inga signifikanta skillnader i apoptoscellindex mellan OSA-gruppen och DHJST-gruppen (P >.05).

3.3. Hämning av VEGF-och HIF-1-expression i broskceller är associerade med DHJST utövar terapeutisk effekt

fluorescerande kvantitativ PCR indikerade att uttrycket av VEGF-mRNA och HIF-1-mRNA är låga i normal grupp; medan aktiviteterna ökar gradvis och signifikant i kontrollgruppen jämfört med den för normal grupp (P < .01); i kontrollgruppen HIF-1 i artikulära chondrocytes börjar öka i den sjätte veckan efter operationen, ytterligare ökningar vid 10: e veckan i jämförelse med den i den sjätte veckan (medelvärdet av SD 94,21 20.12 vid den sjätte veckan och 160.35 72.27 vid den 10: e veckan; P < .05) (Tabell 2). Vid den 10: e helgen minskade uttrycket av VEGF mRNA och HIF-1 mRNA i dhjst-gruppen signifikant jämfört med det i kontrollgruppen efter administrering (P < .01). Även om VEGF-mRNA-och HIF-1-mRNA-nivån i osa-gruppen tenderade att sänkas med 4 veckors OSA-behandling jämfört med den i kontrollgruppen, var det ingen signifikant skillnad (tabell 3).

4. Diskussion

ACLT-modellen är en av de mest använda experimentella modellerna av OA. Kanin ACLT används alltmer i OA-studier eftersom sjukdomsdebut är snabb. Användningen av experimentella ACLT-modeller är av särskild klinisk relevans, eftersom brist på ACL förekommer hos människor och också leder till utveckling av OA. Studie indikerar att stor mängd kondrocyter apoptos existerar under progressivt stadium av OA hos kaniner inducerade genom kirurgi. Chondrocyte apoptos är en av de karakteristiska förändringarna av OA-brosk. Patologisk apoptos under förutsättning av skadlig stimulering kan leda till frisättning av kemotaxi eller inflammatoriska faktorer, vilket i sin tur förvärrar broskskada och aktiverar smärta . Därför kan chondrocyte apoptosis inhibering vara en viktig strategi mot degenerativa förändringar i kaniner knäleder. Chondrocytes apoptosis index i DHJST-gruppen minskar signifikant i jämförelse med i modellgruppen, vilket tyder på att hämning av kondrocyte apoptos kan vara en av de viktiga mekanismerna för DHJST mot degenerativa förändringar.

tidigare studier har visat den hypoxiska naturen hos artikulära kondrocyters mikromiljö. Intressant visade osteoartritiska leder ytterligare minskade syrenivåer, rollen av hypoxi under patogenesen av OA . En ny studie beskrev att i artikulära kondrocyter katabolisk och hypoxisk stress är starka inducerare av transkriptionsfaktorn HIF-1, som är den huvudsakliga regulatorn för cellulär anpassning till låga syrenivåer. HIF – 1 är av avgörande betydelse för överlevnad och tillväxtstopp av kondrocyter under broskutveckling samt energiproduktion och matrissyntes av kondrocyter i friskt såväl som osteoartritiskt brosk. I osteoartritiskt brosk ökar proteinnivåerna av HIF-1 signifikant och dess aktivitet korrelerar med svårighetsgraden av degenerativa broskförändringar . Det nuvarande arbetet dokumenterar vikten av transkriptionsfaktorn HIF-1 msk för att upprätthålla integriteten hos hypoxisk ledbrosk. Överskottsnivåerna av HIF-1 msk sammanföll med ökad apoptos av artikulära kondrocyter och ledde till degenerativa förändringar i kaniner knäleder. Efter administrering av DHJST minskar HIF-1-uttrycket i kg, jämfört med modellgruppens. Resultaten visar att verkan av DHJST på reglerande funktion av kondrocyter, kan genom inhibering av aktiviteten hos HIF-1 msk.

det är intressant att de olika uttrycken av VEGF och HIF-1 GHz mellan DHJST-gruppen och OSA-gruppen är signifikant efter administrering. Flera studier har visat att vissa icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel, såsom indometacin, orsakar antiinflammatoriska effekter oberoende av HIF-1 kg-aktivitet, eftersom indometacin misslyckades med att hämma fosfatidylinositol 3-Kinas eller extracellulärt signalreglerat Kinas/mitogenaktiverat proteinkinasväg, såväl som Erk-aktivitet . I motsats härtill kan indometacin aktivera peroxisomproliferatoraktiverad receptor-XXL, som inte är känslig för natriumsalicylat eller aspirin. Inhibering av fosfatidylinositol 3-Kinas eller Erk-vägen är relaterad till inhibering av HIF-1 msk och angiogena faktorer .

hypoxi och olika tillväxtfaktorer/cytokiner förbättrar VEGF-uttrycket . VEGF är inte bara en av de viktigaste angiogenesfaktorerna, men är också involverad i inflammatoriska processer i OA och bidrar till symtom som smärta och svullnad genom att rikta in sig på synovialmembranen , kroniska inflammatoriska svar är ofta associerade med produktionen av angiogena faktorer som inducerar vaskulär proliferation, och vid reumatoid artrit VEGF uttrycks starkt i synoviala celler . Eftersom mekanisk överbelastning är en av de orsakande faktorerna för OA, studerade vi dess effekt på VEGF-uttryck på kaninens brosk att uttrycket av VEGF minskar efter administrering av DHJST, indikerar resultatet att DHJST kan skydda ledbrosket genom att undertrycka VEGF-uttrycket i kondrocyter (Figur 3).

Figur 3

hypotetiska skyddsmekanismer för DHJST vid brusknedbrytning.

5. Slutsatser

hittills är de bioaktiva ingredienserna i DHJST okända, men vår studie tyder på att DHJST utövar signifikant terapeutisk effekt på OA hos kaniner, genom mekanismer för att hämma kondrocytapoptos och reglera uttrycket av VEGF, HIF-1 msk i kondrocyter. Detta ger vetenskapliga bevis för kliniken att tillämpa DHJST vid behandling av OA.

finansiering

Naturvetenskapsstiftelsen i Shanghai (bidragsnummer: 08JC1418800).