hemolysin från Escherichia coli använder endogen förstärkning genom P2X-receptoraktivering för att inducera hemolys

resultat

HlyA-inducerad hemolys kräver aktivering av Purinerga receptorer.

Supernatant från den E. coli-stammen ard6 lyserar häst–, human–och murina erytrocyter (Fig. 1). Figur 1 visar HlyA-inducerad hemolys som en funktion av tiden. Time-lapse experiment med murina och humana erytrocyter kopplade till täckglas avslöjade att HlyA-inducerad hemolys är en sekventiell process. Inom de första 20 minuterna inducerade HlyA crenation av de röda blodkropparna som ett resultat av cellkrympning, följt av en gradvis volymökning och slutligen lys av cellerna (Fig. 1a och 1b, film S1). Denna sekventiella krympning och svullnad gäller också på encellsnivå. Således är det inte olika populationer av röda blodkroppar som antingen krymper eller sväller utan snarare att en enda erytrocyt först krymper och sedan sväller som en följd av hlya-applicering. Erytrocytsuspensionen (1,25%) inkuberades med utspädd E. coli−supernatant (50 occyl · ml-1). Erytrocyter från de tre testade arterna visade markant skillnad i responsen på HlyA (Fig. 1C) med den lägsta känsligheten för HlyA i humana erytrocyter. I alla följande experiment justerades mängden tillsatt E. coli-supernatant för att producera 50% hemolys efter 60 minuters inkubation.

vi använder vanligtvis filtrerad E. coli (ARD6) supernatant för att inducera hemolys om inte annat anges. Detta tillvägagångssätt valdes för att säkerställa att våra resultat också skulle gälla in vivo där HlyA frigörs från E. coli tillsammans med olika andra komponenter. När vi valde detta tillvägagångssätt måste vi dock verifiera att hemolysen inducerad av HlyA-producerande E. coli faktiskt kunde tillskrivas HlyA. Därför renade vi HlyA från vår ARD6-kultur. Efter rening separerades en suspension av den renade HlyA på en 5-15% natriumdodecylsulfat (SDS) gel. Ett enda 100-kDa-band uppträdde efter coomassie R-färgning, och masspektroskopi identifierade bandet som HlyA (Fig. S1 A och B). Som en extra kontroll använde vi supernatanten från E. coli-stammen D2103, en icke-patologisk laboratoriestam av E. coli som inte producerar HlyA. Supernatanten från dessa bakterier inducerade inte hemolys i humana, murina eller häst erytrocyter (Fig. S1D). Dessutom jämförde vi våra resultat med HlyA vänligt levererat av Prof. Sucharit Bhakdi, University of Mainz, Tyskland (med aktiviteten av 10 ng·ml−1 för 50% hemolys, fig. S2). I det följande, när renad HlyA nämns, är det med hänvisning till denna beredning. Under våra första tester av hlyas biologiska aktivitet upptäckte vi att ATP-scavenger-apyrasen fullständigt inhiberade HlyA-inducerad hemolys av häst erytrocyter. Detta resultat var verkligen överraskande, eftersom det innebar extracellulär ATP som var nödvändig för hemolysen som orsakades av HlyA-producerande E. coli. Eftersom extracellulär ATP är en signalmolekyl som aktiverar P2-receptorer, kan våra resultat föreslå att den rådande pormodellen för HlyA-inducerad hemolys kan vara en förenkling. Därför testade vi effekten av ATP-rensning mer noggrant. Vi fann att apyras fullständigt inhiberade hemolys av inte bara häst utan också murina och humana erytrocyter (Fig. 2A). Dessutom minskade hexokinas, som snabbt bryter ned adenosintrifosfat (ATP) till adenosindifosfat (ADP), på samma sätt hlya-inducerad hemolys i röda blodkroppar av murin och mänskligt ursprung på ett koncentrationsberoende sätt (Fig. 2B). Detta resultat verifierades av renad HlyA (Fig. 2B, infälld). Det är värt att notera att i humana erytrocyter potentierade både apyras och hexokinas den HlyA-inducerade hemolysen vid lägre koncentrationer. Skillnaden kan föreslå en skillnad i P2-receptoruttrycksmönster på de röda blodkropparna mellan arten.

för att validera relevansen av detta resultat var det viktigt att lära sig om P2-receptorantagonister påverkade HlyA-inducerad hemolys. Den icke-selektiva P2-receptorantagonisten ppads koncentrationsberoende minskade hemolys inducerad av HlyA-producerande E. coli i häst -, Murin-och humana erytrocyter (Fig. 2C). EC50-värdet för PPADS var 520 kg, 400 kg och 180 kg för humana, murina respektive häst erytrocyter. Detta resultat underbyggdes för hela hlya-koncentrationerna (Fig. 2D) testad i humana erytrocyter exponerade för renad HlyA. Koncentrations-responsförhållandet var kompatibelt med konkurrerande antagonism, och det bör noteras att effekten av till och med maximala toxinkoncentrationer reducerades av P2-receptorblockeraren. Således verkar P2-receptoraktivering vara involverad i HlyA-inducerad hemolys. Den icke-selektiva P2-receptorantagonisten suramin minskade också koncentrationsberoende HlyA-inducerad hemolys hos alla tre arterna (data visas inte). I högre koncentrationer orsakar suramin dock dramatisk erytrocytkrympning och kan därför inte vara lämplig för utvärdering av P2-receptorimplikation i erytrocyter.för att utvärdera om effekten av den purinerga antagonisten på hemolys bara var ett resultat av ökad osmolalitet testade vi effekten av extracellulär sackaros på HlyA-inducerad hemolys (data visas inte). Sackaros (1 mM) minskade endast något hemolys (5,1% 1,7% i 10 mm och 75 mm sackaros minskade markant hemolys (28.5% ± 5.0%, 82.8% ± 5.2%). Med tanke på att koncentrationerna av antagonister och Atpaser som användes i denna studie aldrig översteg 1 mM, kan effekten inte vara resultatet av ökad osmolaritet. Inte heller återspeglade våra resultat oselektiv bindning mellan antagonisterna och toxinet. Detta testades i häst erytrocyter, som preinkuberades med HlyA i 10-15 minuter vid 37 kg eller i 30 minuter vid 4 kg, tvättades noggrant och suspenderades igen med eller utan antagonisterna. Eftersom HlyA införlivas i membranet under preinkubationen fortsatte erytrocyterna att lysas i frånvaro av fri HlyA. Fig. S2 visar att olika farmakologiska ingrepp minskade hemolys efter att HlyA var förbundna med erytrocyterna. Antagonisterna var emellertid mindre effektiva när de tillsattes till tvättade erytrocyter där den lytiska processen redan initierades.

vilken P2-Receptor(er) är involverad i HlyA-inducerad hemolys?

erytrocyter uttrycker olika typer av P2-receptorer. P2-receptorerna som har rapporterats uttryckas i mogna humana erytrocyter inkluderar P2Y1 (14), P2Y2 (15), P2Y13 (15), P2X1 (15) och P2X7 (16), medan P2Y1, P2X1, P2X4 och P2X7 verkar vara närvarande i erytroida stamceller (17). För att testa vilken av dessa purinerga receptorer som deltar i den HlyA-inducerade hemolysen, behandlade vi receptorerna i fråga individuellt. Eftersom p2y1-receptorn är inblandad i sorbitolinducerad hemolys av plasmodiuminfekterade humana och murina erytrocyter (14) testade vi om denna receptor var ansvarig för HlyA-inducerad hemolys. P2y1-receptorantagonisten MRS2179 påverkade inte den HlyA-inducerade hemolysen (Fig. S3A) vid koncentrationer (upp till 500 occurm) utöver vad som behövdes för att hämma hemolys i Plasmodium berghei-infekterade erytrocyter (14). Eftersom det inte finns några specifika antagonister för P2Y2-receptorer undersökte vi effekten av HlyA i transgena möss. Den HlyA-inducerade hemolysen var liknande i erytrocyter från p2y2 – / – och P2Y2+ / + – möss (Fig. S3B). I fallet med P2Y13 testade vi antagonisten MRS2211, som har rapporterats visa viss selektivitet mot p2y13-receptorn (18). MRS2211 minskade HlyA-inducerad hemolys signifikant i humana och murina erytrocyter (Fig. S3C). Detta resultat strider mot våra resultat med hexokinas (nedbrytande ATP till ADP), vilket bör stimulera snarare än att hämma den ADP-känsliga p2y13-receptorn. Därför bör hexokinas och MRS2211 ge motsatta resultat om p2y13-receptorn är involverad. Eftersom detta inte är fallet är p2y13-receptorn en osannolik kandidat för P2-receptorn involverad i HlyA-inducerad hemolys. Vi kan inte utesluta möjligheten att inhiberingen som produceras av MRS2211 medieras genom en annan P2-receptor.

i princip lämnar detta endast P2X-receptorerna att övervägas. Fig. 3A visar att den icke-selektiva blockeraren av P2X-receptorer Evans blue kraftigt reducerade HlyA-inducerad hemolys, vilket tyder på att en P2X-receptor är involverad i denna hemolys. Av P2X-receptorerna uttryckta i erytrocyter betraktade vi P2X7 som den mest troliga medlaren av HlyA-inducerad hemolys av följande skäl. P2x7-receptorerna är kända för att genomgå en övergång till ett större permeabilitetstillstånd, vilket så småningom leder till lys i vissa celler (12). P2x7-receptorn har rapporterats interagera med kanalproteinet pannexin1 (12), och komplexet skapar en stor porgenomsläpplig för större molekyler såsom etidiumbromid (13). Pannexin1 uttrycks i humana röda blodkroppar (19) och har nyligen föreslagits som ATP-frisättningskanalen i erytrocyter (20). För att testa om p2x7-receptorer deltar i HlyA-inducerad hemolys använde vi antagonister med relativ selektivitet för P2X7: lysande blå G (BBG), ATP-2′, 3′-dialdehyd (OxATP) och KN-62 (21). Alla antagonister koncentrationsberoende minskade hemolys i häst -, Murin-och humana erytrocyter (Fig. 3). Häst-och humana erytrocyter var känsligare för alla de testade ämnena jämfört med murina erytrocyter. I detta sammanhang bör det nämnas att den murina p2x7-receptorn är känd för att vara mindre känslig för KN-62 jämfört med den humana receptorn (22). Skyddet mot hemolys genom P2X-receptorantagonism underbyggdes igen för hela koncentrationsområdet av renat HlyA i humana erytrocyter med användning av BBG som ett exempel på en p2x7-antagonist (Fig. 3D). Återigen visar antagonisten en väsentlig effekt på HlyA-inducerad hemolys även under hlya-koncentrationer som gav maximal hemolys. Inhiberingen av hemolys av OxATP verifierades med användning av renad HlyA i murina och humana erytrocyter (Fig. 3e, infälld). Den nya selektiva, konkurrerande p2x7-receptorantagonisten a438079 minskade hemolysen i humana erytrocyter, men var mindre effektiv i murina erytrocyter (Fig. 3F). Immunoblots av plasmamembranfraktioner för p2x7-receptorn bekräftar att humana och murina erytrocyter uttrycker ett protein av relevant Storlek (66 kDa, Fig. 3G, och i sin helhet i Fig. S4B). Det kommer att kräva ytterligare undersökning för att fullständigt fastställa det relativa bidraget från P2X-receptorer i HlyA-inducerad hemolys. Med våra nuvarande verktyg kan vi inte utesluta möjligheten till bidrag från andra P2X-receptorer i HlyA-inducerad hemolys hos någon av de studerade arterna.

Fig. S4A visar HlyA-inducerad hemolys i murina (P2X7+/+ och P2X7−/−) erytrocyter. De murina erytrocyterna visar en liknande grad av hemolys som svar på HlyA oavsett deras genotyp. P2X7 – / – mössen och p2x7+ / + – mössen genererades ursprungligen av Pfizer och korsades tillbaka till BALB/c-bakgrund. Vi upptäckte inte några skillnader mellan känsligheten för HlyA-inducerad hemolys i erytrocyter isolerade från BALB/c och C57BL/6-möss (data visas inte), även om C57BL/6-stammen är känd för att ha en genetisk variation i C-änden av p2x7-receptorn (23). Dessa data överensstämmer med den minsta effekten av A438079 på murina erytrocyter och det låga proteinuttrycket av p2x7-receptorn i murina erytrocyter (Fig. 3F och 3G).

dessa resultat antyder att det finns minst en ytterligare P2-receptor involverad i HlyA-inducerad hemolys i murina erytrocyter. Eftersom P2X1 och P2X7 delar liknande inhibitorprofiler för BBG, KN – 62 och OxATP (24) testade vi P2X1-antagonisterna MRS2159 och NF449. MRS2159 koncentrationsberoende inhiberad hemolys i erytrocyter från häst (EC50:150 oc) och mus (EC50: oc 250 oc). Mänskliga erytrocyter var relativt okänsliga för antagonisten, men vid en koncentration över 250 micrm såg vi en liten och statistiskt signifikant reduktion (Fig. 4A). Denna effekt var mycket mer uttalad om renad HlyA användes (Fig. 4C). Detta innebär att det kan finnas skillnader i det cellulära svaret med avseende på huruvida de utsätts HlyA i ren form eller i kombination med andra E. coli-beståndsdelar. Nf449-koncentrationsberoende hämmar HlyA-inducerad hemolys hos människa (Fig. 4B). NF449 var mycket mindre effektiv i murina erytrocyter i överensstämmelse med den murina P2X1-receptorn som var relativt resistent mot denna hämmare (25). Det bör betonas att även om NF449 är ett suraminderivat orsakade det inte samma volymförändringar i erytrocyter som suramin. Immunoblots av P2X1-receptorn är kända för att visa upp till 4 band i olika vävnader; ett 45 kDa icke-glykosylerat, ett 60 kDa glykosylerat och ett 95/120 kDa-band som kan vara den polymeriserade formen av receptorn (26, 27). I våra händer kände P2X1-receptorantikroppen konsekvent ett 45 KD-band och ett mycket svagt 60 kDa-band i blottar av plasmamembran från murina och humana erytrocyter (Fig. 4D). Intressant fann vi att uttrycksnivån 60 kDa-bandet var mycket högre i p2x7−/− mössen jämfört med kontroller (liknande i tre preparat, Fig. 4D). I denna immunoblot justeras proteinnivåerna för att undvika överbelastning av banden från p2x7−/− mössen, vilket lämnar 60 kDa-bandet nästan odetekterbart i p2x7+/+ – mössen. Denna uppenbara uppreglering av P2X1–receptorn kan potentiellt dölja en hemolytisk fenotyp i p2x7-receptorbristande möss. Sammantaget stöder dessa data hypotesen att både P2X1-och P2X7-receptorn är relevanta för HlyA-inducerad hemolys. Våra resultat pekar på signifikanta interspeciesvariationer, där p2x7-receptorn är viktigare för hemolys i humana erytrocyter.

HlyA-inducerad hemolys förhindras av Pannexin1-antagonister.

karbenoxolon (28), meflokin och probenecid (30) har använts som antagonister med relativ selektivitet för pannexin1. Karbenoxolon minskade signifikant nivån av hemolys i alla tre arter med liknande känslighet (Fig. 5A). Effekten av karbenoxolon testades igen för hela intervallet av hlya-koncentrationer (renat toxin, Fig. 5B), som också visar betydande effekter under maximala hlya-koncentrationer. Meflokin och probenecid testades endast i murina och humana erytrocyter. EC50 för meflokin var 25 kg i människa och 18 kg i murina erytrocyter. Probenecid inhiberade hemolys i humana erytrocyter, med en EC50 av 2 mM, men var mindre effektiv i murina erytocyter. Nyligen har de kända Cl-kanalantagonisterna NPPB och nifluminsyra visat sig hämma pannexinkanaler också (31). Båda substanserna reducerade hlya-inducerad hemolys, med en väsentligt mer uttalad effekt på humana erytrocyter (Fig. S5).