humana T-celler uttrycker CD25 och Foxp3 vid aktivering och uppvisar effektor/minnesfenotyper utan någon reglerande/suppressorfunktion

aktivering av T-celler inducerar uttryck av CD25 och Foxp3 associerad med effektor och minnesfenotypdifferentiering

PBMC stimulerades med bryostatin-1 (5 nM) och jonomycin (1 kg) (B/I) i närvaro av 80 U/ml IL-2 (peprotech) under 16 timmar. B / i-aktivering efterliknar intracellulära signaler som resulterar i T-cellaktivering genom att öka proteinkinas C-aktivitet respektive intracellulärt kalcium . Celler tvättades tre gånger och odlades vid 106 celler/mL i fullständigt medium med 40 U/mL IL-2 (Peprotech) i 3 dagar och uttryck av Foxp3 bestämdes med användning av flödescytometrianalys. Uttryck av FoxP3 bestämdes också på nyligen isolerade T-celler på dag 0. Såsom visas i Fig. 1A (övre panelen), närvaron av IL-2 ensam i 3 dagar ökade inte markant uttrycket av Foxp3 eller CD25 över baslinjenivåerna dag 0 (Fig. 1C). B / i-aktiveringen inducerade emellertid Foxp3-och CD25-uttryck i CD4 + – och CD8+ T-celler (Fig. 1A, mittpanelen). Vid b / I-aktivering ökades CD4+CD25+Foxp3+ T-celler från 1% till 23% (P = 0,016) och CD8+CD25+Foxp3+ T-celler ökades från 0,6% till 9% (P = 0,013). Förlängning av odling i närvaro av IL – 2 i 6 dagar utan ytterligare stimulering behöll CD4+CD25+Foxp3+ T-celler över baslinjenivåerna i oaktiverade T-celler (1% mot 7%; P = 0,031) medan CD8+CD25+Foxp3+ T-celler sjönk till baslinjenivåerna (0,6%). Dessa resultat tyder på att aktiveringsinducerat uttryck av Foxp3 i CD4+CD25+ T-celler är stabilare än i CD8+CD25+ T-celler. Absolut antal T-celler ökade 3 och 6 dagar efter b / I-stimulering och expansion i närvaro av IL-2 (Fig. 1B). Aktivering av T-celler med hjälp av anti-CD3 / CD28 Abs i 3 dagar gav liknande resultat som För B / I-aktivering genom att öka CD4+CD25+FoxP3+ T-celler från 0,4% till 8,7% (Fig. 1C). Fenotyp analyser av T-celler avslöjade CD44 + effektor och CD44 + CD62L + minne fenotyper före och 6 dagar efter b / I aktivering (Fig. 1D, övre panelen). Medan effektor CD4 + och CD8+ T-celler reducerades efter aktivering (18% till 9% respektive 21% till 13%), minne CD4+ och CD8+ T-celler ökades (82% till 91% respektive 79% till 87%). Vid b / i-aktivering visade CD4+ T-celler en 6-faldig ökning av FoxP3-uttryck i CD44+, CD62L+ fenotyper (CD44+: 2,6% till 15%; CD62L+: 2% till 12%). Dessutom visade både CD4+ och CD8+ T-celler Foxp3högt uttryck efter aktivering jämfört med FoxP3low-uttryck på dag 0 (Fig. 1D, mitten och botten paneler). Alla CD4 + Foxp3 + T-celler uttryckte CD44 bland vilka 80% också uttryckte CD62L (Fig. 1D, mittpanel, längst till höger). Dessa data visar att 20% av CD4 + Foxp3 + T-celler är effektor och 80% är minnesfenotyper. En liknande fenotypisk trend detekterades för CD8 + Foxp3 + T-celler, som visar 100% CD44+ varav 67% var CD62L+ T-celler (Fig. 1D, nedre panelen, längst till höger). Dessa resultat visar att 33% av CD8 + Foxp3 + T-celler är effektor och 67% är minnesfenotyper. Data som presenteras i Fig. 1A-d föreslår att ökat uttryck av FoxP3high i effektor T-celler berodde på celldifferentiering snarare än cellproliferation, eftersom relativ procent av CD44+CD62L – effektor T-celler minskade efter b/I-aktivering. Liknande mekanism kan existera i minnes-T-celler på grund av uttrycket av FoxP3high efter aktivering jämfört med FoxP3low på dag 0.

Aktiveringsinducerat FoxP3-uttryck i CD4+ T-celler misslyckas med att förmedla reglerande funktion in vitro

T-celler märktes med CFSE och stimulerades med anti-CD3 (1 ug/ml) och anti-CD28 (1 ug/ml) Abs i närvaro eller frånvaro av den B/i-aktiverade CD4+CD25+Foxp3+ T-celler (2:1 och 20:1 responder:suppressor-förhållanden) i 3 dagar. Flödescytometrianalys visade liknande proliferationshastigheter av gated CD8 + T-celler i frånvaro eller närvaro av inducerbara FoxP3+ T-celler (Fig. 2A, 60% mot 61% och 65%). CD3 / CD28-aktiveringen inducerade också FoxP3-uttryck i responder CD4+ T-celler. Gated CD4 + FpxP3 + T-celler visade också 70-75% proliferation vid aktivering (Fig. 2A). Analys av T-cell apoptos avslöjade liknande hastigheter av apoptos i responder T-celler i frånvaro eller närvaro av CD4+FoxP3+ T-celler (Fig. 2B, 57% mot 57 och 59%). Majoriteten av de b/i-aktiverade CD4+FoxP3+ T-cellerna (74-76%) befanns vara apoptotiska under anti-CD3 / CD28-aktivering i samodling med responder-T-celler.

allogen aktivering av T-celler under MLR inducerar Foxp3-uttryck i CD4+CD25+ T-celler associerade med effektor/minnesfenotyp

Vi utförde en 8-dagars allogen MLR för att avgöra om induktion av Foxp3-uttryck i T-celler var stabil under MLR och om ett sådant inducerat Foxp3+ – uttryck kan hämma t-cellproliferation. Responder-och stimulatorceller erhölls från olika friska givare. Stimulatorceller bestrålades (5000 rad) och odlades med responderceller i 8 dagar i närvaro av 10 oc-m BrdU (BD Pharmingen). Celler färgades sedan med relevant Abs och utsattes för flödescytometrianalys. Såsom visas i Fig. 3A (toppanel) 86% av CD4+CD25+ T-celler och 93% av CD8+CD25+ T-celler visade BrdU-inkorporering som ett resultat av cellproliferation. Ingen proliferation detekterades enbart i responder-eller stimulatorcellerna (data visas inte). Sådan allogen proliferation ägde rum i närvaro av ett aktiveringsinducerat Foxp3-uttryck i CD4+ T-celler så att 8% av CD4+ T-celler var CD25+Foxp3+ (Fig. 3A, nedre panelen). CD8 + CD25 + T-celler, å andra sidan, visade inte stabilt uttryck för Foxp3. Dessa resultat överensstämmer med vår observation i Fig. 1 visar att uttrycket av Foxp3 i CD4 + T-celler är stabilare än i CD8+ T-celler 6-8 dagar efter T-cellaktivering. I tidigare rapporter utfördes undertryckande analyser in vitro i närvaro av höga förhållanden av CD4+CD25+ T-celler (Tregs) till responderceller, för att bestämma den undertryckande funktionen vid T-cellaktivering och proliferation. Sådana artificiella ökningar i förhållandet mellan CD4+CD25+ T-celler till responderceller skulle minska observationens in vivo-giltighet. Frekvensen av CD4 + CD25 + Foxp3 + T-celler inducerade under MLR var 8% vilket anses ligga inom det fysiologiskt relevanta intervallet som rapporterats av andra grupper . Frekvensen av naturligt förekommande Tregs i mus ligger också runt detta område, men har ändå reglerande effekter för inhibering av autoimmunitet. Om Foxp3-Uttryckande CD4 + T-celler hade någon reglerande funktion, borde den ha hämmat cellproliferation under odlingen in vitro. I likhet med B / I-inducerad T-cellaktivering inkluderade t-cellfenotyper i en MLR CD44 + effektor (16%) och CD44+CD62L+ minnes-T-celler (84%) (Fig. 3B). Återigen uttryckte alla CD4 + Foxp3 + T-celler CD44 bland vilka 90% också uttryckte CD62L (Fig. 2B). Dessa data visar att 10% av CD4+Foxp3+ T-celler är effektor och 90% är minnesfenotyper. En liknande fenotypisk trend detekterades för CD8 + Foxp3 + T-celler, som visar 100% CD44+ varav 76% var CD62L+ T-celler. Dessa resultat visar att 24% av CD8 + Foxp3 + T-celler är effektor och 76% är minnesfenotyper. Brist på reglerande funktion i dessa Foxp3 + T-celler kan bero på deras effektor/minnesfenotyp eftersom det har rapporterats att uttryck av Foxp3 i humana minne T-celler resulterade i minskad suppressoraktivitet . Dessutom ger Treg typ 1 (Tr1) celler suppressorfunktion i frånvaro av FoxP3-uttryck . Med tanke på Foxp3: s roll som huvudregulator för Treg-linjärengagemang och underhåll i mus verkar det inte ha en sådan bona fide reglerande funktion för Treg-linjärengagemang i humana T-celler.