- identifiering av pou5f1-och SOX2-förstärkare interaktomer
- interaktomerna i pou5f1-och SOX2-förstärkare överlappar varandra med tidiga DNA-replikeringsdomäner men inte med heterokromatiska regioner
- förstärkarinteraktomerna gränsar till transkriptionsstartplatser och har aktiva epigenetiska egenskaper
- Transkriptionsstatus för POU5F1-och SOX2–förstärkarinteraktiva gener
- distala gener associerade med pou5f1–förstärkaren är involverade i regleringskretsarna för pluripotency
- flera transkriptionsfaktorbindningsställen berikas i POU5F1 och SOX2 förstärkare interaktomer
- RAD21 är potentiellt i komplex med andra transkriptionsfaktorer för att förmedla förstärkarinteraktomerna
identifiering av pou5f1-och SOX2-förstärkare interaktomer
de förmodade pou5f1-och SOX2-förstärkarregionerna är evolutionära konserverade över ryggradsdjur (44 arter), med aktiva förstärkarsignaturer definierade av epigenetiska märken som p300-Histon acetyltransferas och H3K27AC men inte h3k27me3 i Hescs7 ( kompletterande Fig. 1A). Vi tillämpade 4C-tekniken för att identifiera de interagerande partnerna för ”bete” förmodade förstärkare av POU5F1 och SOX2 i pluripotent h9-cellinjen. I korthet fixerades cellerna till tvärbindningskromosomer i närheten. Kromosomerna fragmenterades sedan av ultraljudsbehandling. Interagerande kromatinfragment ligerades och DNA-bitarna renades. Genomiska regioner som interagerar med ”betet” förstärktes sedan med kapslad PCR (kompletterande Fig. 1b, kompletterande Tabell 1). Vi designade inversa PCR-primrar för att rikta in förmodade förstärkare av POU5F1-och SOX2-generna. Det konstruerade 4C-biblioteket kunde visualiseras genom DNA-elektrofores, medan kontrollen utan ligering visade nästan inga PCR-produkter (kompletterande Fig. 1B), vilket indikerar att 4C-biblioteket förstärktes från ligeringsprodukter.vi utförde nästa generations DNA-sekvensering med hjälp av en Illumina HiSeq-sekvenserare och klassificerade de identifierade 4C-interaktionerna som antingen proximala eller distala interaktioner (se metoder). Distala interaktioner inkluderar interkromosomala interaktioner och intra-kromosomala interaktioner över genomiska avstånd större än 20 kb, medan proximala interaktioner täcker intra-kromosomala regioner med genomiska avstånd mellan 300 bp och 20 kb. I överensstämmelse med resultaten från 3C–baserade studier står vår distala interaktionsläsning för endast en liten del av de totala interaktionerna, ungefär 10% ~ 20% för 4C-biblioteken ( kompletterande Tabell 2 ). Vi använde två olika satser av H9-celler för att konstruera 4C-biblioteken för POU5F1 och SOX2 oberoende för nästa generations sekvensering. De två replikaten av pou5f1 och SOX2 distala interaktioner överlappar varandra med 35% respektive 25%. Detta överensstämmer med den måttliga överlappningen som observerats i biologiska replikat av ctcf–medierade kromatinininteraktomer i mus ES-celler27 och kan återspegla mångfalden och dynamiken i förbättringsinteraktioner, ligeringseffektivitet, komplexitet av PCR-amplifiering såväl som sekvenseringsdjup. För att filtrera bort interaktioner som sannolikt berodde på stokastiska effekter använde vi en FDR-baserad statistisk modell (false discovery rate) för att identifiera de berikade interagerande domänerna över hela genomet. Vi fusionerade vidare de berikade interagerande domänerna som överlappar mellan de biologiska replikaten som högförtroende frekventa interagerande domäner. Totalt identifierades 23 och 9 högförtroende frekventa interagerande domäner för pou5f1 respektive SOX2-interaktomerna ( Figur 1 , kompletterande tabell 3, 4 ) och de flesta av dem är interkromosomala interaktioner som involverar genrika regioner, liknande E4C-resultaten20.
Circos kartor över de distala interaktioner presenteras med Circos software52.
den blå yttre ringen representerar gendensitetsprofilen.
interaktomerna i pou5f1-och SOX2-förstärkare överlappar varandra med tidiga DNA-replikeringsdomäner men inte med heterokromatiska regioner
vi undersökte därefter om pou5f1-och SOX2-förstärkaren interagerar domäner (storlek från 1 Mb till 4 Mb, kompletterande tabell 3, 4 ) har några unika epigenetiska egenskaper. Som Ryba et al. visad28 korrelerar DNA-replikationstidpunkten med den rumsliga närheten av kromatin mätt med Hi-C-analys, vilket tyder på att tidig och sen DNA-replikation förekommer i rumsligt distinkta fack i kärnan. Vi märkte att POU5F1-och SOX2-genlokalerna ligger inom tidiga DNA-replikeringsdomäner i hESCs och undrade om deras interagerande domäner har en liknande DNA-replikeringstidpunkt. Som visas i Figur 2a överlappar pou5f1-och SOX2-förstärkarens interagerande domäner huvudsakligen med tidiga DNA-replikationsdomäner i hESCs. Fördelningen av analyserade replikationstidvärden inom de genomiska regionerna kring de identifierade pou5f1-och SOX2-förbättringsinteraktiva platserna (50 kb-intervall) visar ett skifte mot positiva värden jämfört med genombredda arrayvärden (P < 2.2 msk 10-16 för båda, genom oparade Wilcoxon rank-sum test; Figur 2B). Denna observation avslöjade en intressant epigenetisk funktion, att högre ordningsstrukturer som omger pou5f1-och SOX2-förstärkarna har synkroniserat DNA-replikeringstidpunkten. Eftersom tidiga DNA-replikationsdomäner har kopplats till aktiv gentranskription i hESCs28 är det troligt att interaktionerna mellan POU5F1 och SOX2-förstärkare med de identifierade distala regionerna har funktionell betydelse. Denna observation överensstämmer med vad vi har sett i POU5F1 enhancer interactome i mus ES-celler (data visas inte). Avslöjade också i Figur 2a, pou5f1 och SOX2 samverkande domäner överlappar inte med heterokromatiska regioner märkta med starka h3k9me3-signaler i hESCs29, vilket tyder på att interaktomerna ligger inom en aktiv del av genomet när det gäller genreglering. Dessutom undersökte vi ett potentiellt förhållande till de nukleära laminaassocierade domänerna (LADs) av mänskliga kromosomer30, men observerade ingen koppling, möjligen på grund av att killarna bestämdes i humana fibroblaster.
förhållandet mellan interaktomerna och DNA-replikationsdomäner och heterokromatiska regioner.
interaktiva webbplatser inom de frekventa interaktiva domänerna presenteras i (2A) (endast Chr1 och Chr2 visas). (2b), jämförelse av fördelningen av DNA-replikationstidpunkten (RT) arrayvärden för regionerna inom 50 kb av de interagerande platserna för hela genomet.
förstärkarinteraktomerna gränsar till transkriptionsstartplatser och har aktiva epigenetiska egenskaper
för att utforska korrelationen mellan POU5F1 och SOX2-förstärkarinteraktomer med kommenterade genplatser analyserade vi fördelningen av det genomiska avståndet mellan förstärkarinteraktionsställena till närmaste gentranskriptionsstartplats (TSS) ( figur 3A ). Kärndensitetsplottorna för både POU5F1–och SOX2-förbättringsinteraktiva platser visar tydligt en skarp topp centrerad vid TSS. Jämfört med fördelningstoppen för slumpmässigt simulerade platser i hela genomet är topparna som observerats i förstärkningsinteraktomerna signifikant högre inom ett smalt fönster runt TSS (P = 0,0018, p = 0,0047 respektive Kolmogorov-Smirnov-testet). Anrikning av de interagerande platserna runt TSS antyder att pou5f1-och SOX2-förstärkare föredrar att interagera med genomiska regioner som innehåller gener. Vi undersökte vidare distributionen av POU5F1–och SOX2-förbättringsinteraktiva platser i olika genomiska regioner31. Visas i figur 3B, genpromotorsekvenser är en av de berikade regionerna för både POU5F1-och SOX2-förstärkarinteraktomerna. Dessutom reduceras fraktionen av distala intergena regioner konsekvent för de två interaktomerna. Därför föreslår vår observation att den högre ordningens kromosomstruktur som omger de aktiva förstärkarna kan vara direkt involverad i genreglering. Noteras också, när slumpmässiga platser i de tidiga DNA-replikationsområdena (se metoder för detaljer) väljs för att jämföra avståndsfördelning till TSS, är pou5f1-och SOX2-interaktomerna fortfarande mer berikade kring TSS,även om de statistiskt inte är signifikanta (P = 0.390, 1 P = 0.2098, Kolmogorov-Smirnov-testet, kompletterande Fig. 2 ).
(A) Kärndensitetsuppskattning av genomiskt avstånd från de interagerande platserna till närmaste TSS-platser. Avstånd beräknades med HOMER-programvara34. Täthetskartor över 100 000 slumpmässiga platser i hela genomet ingår också. (B) Anrikningsanalys av interaktomerna i olika genregioner. Distributionsanalys utfördes med CEAS-programvara31.
Histonmodifiering är känd för att vara involverad i transkriptionsreglering genom att dekondensera kompakta kromatinstrukturer för transkriptionsfaktorbindning. 3C–baserade genomomfattande interaktomstudier har identifierat aktiva och inaktiva kromatinfack i kärnan, med aktiva fack berikade med histonmärken som aktiverar gentranskription, såsom H3K9ac32. Vi frågade därför om aktiva förstärkare av POU5F1 och SOX2 selektivt interagerar med distala regioner som visar aktiv gentranskription. ChIP-Seq tag profiler av H3K27me3, H3K4me1, H3K4me2, H3K27ac, H3K9ac, H4K20me1 och H3K36me3 i H1 ES cell line33 användes för att analysera histonmönster associerade med interaktomerna. ChIP-SEQ taggar runt enhancer samverkande platser räknades och normalized34 och visualiseras som boxplot. Som noterat har pou5f1-och SOX2-interaktomer högre intensitetsprofiler av H3K4me1, H3K4me2 och H4K20me1, vilka är märken för genaktiv reglering ( figur 4A ). Jämfört med de slumpmässiga platserna i tidiga DNA-replikationsområden är de undersökta histonmärkena i allmänhet mer berikade i pou5f1-interaktomen än i SOX2-interaktomen, med H3K4me1 och H3K9ac är de mest signifikant berikade i pou5f1-interaktomen (P < 2.2 msk 10-16 för båda märkena, oparade Wilcoxon rank-sum test). Intressant är att Polycomb-medierad gendämpningsmärke H3K36me335 inte berikas i någon interaktom (P = 0,485, p = 0,922). Vi undersökte också förhållandet mellan POU5F1 och SOX2 förstärkare interaktomer med 5-hydroximetylcytosin (5-hmC) platser i genomet. Som en tidigare studie avslöjade berikas genomiska 5-hmC-platser vid aktiva förstärkare i hESCs36. Eftersom POU5F1 och SOX2 uppströmsförstärkare gränsar till 5-hmC-platser (inom 5 kb) frågade vi om förstärkarinteraktomerna också berikas med 5-hmC-platser. Visas i Figur 4B, 5-hmC-platser berikas i närheten av POU5F1 och SOX2-interaktomer jämfört med de slumpmässiga platserna i tidiga DNA-replikeringsområden (P < 2,2 10-16, p = 0,047 respektive Kolmogorov-Smirnov-test). Således har de två förstärkarinteraktomerna i hESCs epigenetiska egenskaper hos aktiva förstärkare, vilket kan underlätta aktiv reglering av gentranskription.
(a) Boxplot av olika histonmärken runt de interagerande platserna och slumpmässiga platserna. ChIP-Seq-taggar inom 5 kb från en interagerande plats räknades och normaliserades. (B) Avståndsfördelning av de interagerande platserna och slumpmässiga platser till närmaste 5-hmC-plats jämfördes. 100 000 slumpmässiga platser genererades från tidiga DNA-replikationsområden för jämförelse.
(a) jämförelse av rpkm-värden för de interagerande generna (gener med en TSS 10 KB från de interagerande platserna) med alla humana Ensembl-gener (genomsnittliga rpkm-värden från replikera RNA-seq-data i koda användes). (B) differentiellt uttryck analyserades för att jämföra interaktomgener i hESCs och fetala lungfibroblaster.
Transkriptionsstatus för POU5F1-och SOX2–förstärkarinteraktiva gener
för att förstå transkriptionsstatusen för gener associerade med POU5F1-och SOX2-förstärkare analyserade vi RNA-Seq-transkriptomdata i hESCs och fetala lungfibroblaster37, med fokus på gener som har en TSS inom 10 kb av enhancer-samverkande platser. I hESCs är expression av POU5F1 och SOX2 enhancer–interagerande gener signifikant högre än för alla gener i hESCs (P = 7,5 kcal 10-6 och P = 1.2 10-6, respektive, genom oparade Wilcoxon rank-sum test; figur 5A), vilket indikerar att interaktomerna berikas med aktivt transkriberade gener. Således kan aktiva pou5f1-och SOX2-förstärkare vara involverade i att förmedla transkription av de associerade distala generna. RNA-Seq-transkriptomanalys avslöjade också att generna som ursprungligen associerades med aktiva POU5F1-och SOX2-förstärkare i hESC: er är nedreglerade i differentierade lungfibroblaster (P = 1,2 10-5 och p = 0,013, med parat Wilcoxon rank-sum-test; figur 5B ). Dessa resultat indikerar att förstärkarna av dessa två stamnessrelaterade gener interagerar med en grupp gener som uttrycks starkt i hESC men undertrycks i fibroblaster.
distala gener associerade med pou5f1–förstärkaren är involverade i regleringskretsarna för pluripotency
för att undersöka om POU5F1-och SOX2-förstärkarinteraktiva gener bidrar till självförnyelse och pluripotens av hESCs, analyserade vi en data från en GENOMOMFATTANDE RNA-interferensskärm med hjälp av en POU5F1-promotorreporter-analys i hESCs38. Interferens av transgen pou5f1-GFP-uttryck kvantifieras med Fav-värden som återspeglar GFP-fluorescensintensitet, vilket representerar benägenheten att vara stamrelaterad ( figur 6a ). I jämförelse med alla screenade gener visar POU5F1–förstärkarinteraktiva gener (gener närmast de interagerande platserna, med genomiskt avstånd från TSS till de interagerande platserna mindre än 10 kb) en trend med minskande Fav-värden, även om de statistiskt inte är signifikanta (P = 0,08, oparat Wilcoxon rank-sum test). Men för SOX2-riktade gener liknar Fav-värdena alla de screenade generna (P = 0.98, oparad Wilcoxon rank-sum test). Därför, baserat på dessa data, verkar gener i pou5f1-interaktomen vara viktigare för stamcellspluripotens än gener i SOX2-interaktomen.
(a) korrelation mellan interaktomgenerna och pluripotensen. De interagerande generna screenades i en siRNA-analys med POU5F1-GFP-reportergen i hESCs inkluderades för analys. Fördelning av Fav-värden (förändring av fluorescens) för de interagerande generna jämförs med alla 21122 gener som screenas i den ursprungliga analysen. (B) analys av differentiellt uttryck av identifierade transkriptionsregulatorer i hESCs och fetala lungfibroblaster.
Gen ontologi analys39 av 39 POU5F1-interagerande gener och 20 SOX2–interagerande gener avslöjade att en betydande del av dem skulle vara involverade i transkriptionsreglering (30,8% och 35,0% för pou5f1 respektive SOX2-interaktomer; Kompletterande Tabell 5, 6) och distribueras till 8 och 4 olika interagerande domäner i pou5f1 respektive SOX2-interaktomerna, med högst 3 gener i en interagerande domän. Differentiell expressionsanalys av dessa transkriptionsregulatorer i hESCs och fetala lungfibroblaster avslöjade 9 av dem i pou5f1-interaktomen (11 av 12 identifierade transkriptionsregulatorer har RNA-Seq-data) för att ha högre uttryck i hESCs ( figur 6b ), vilket tyder på aktiva roller för dessa gener i pluripotency regulatory network i hESCs. För de transkriptionsregulatorer i SOX2 interactome, 3 av 5 visade ökat uttryck i hESCs. Därför kan pou5f1 enhancer interactome spela en större roll i stamcell pluripotency än SOX2 enhancer interactome.
flera transkriptionsfaktorbindningsställen berikas i POU5F1 och SOX2 förstärkare interaktomer
Transkriptionsfaktorbindning är en av de egenskaper som förstärkare besitter och det kan underlätta långväga kromatin–kromatin interaktioner av förstärkaren med distala gener. POU5F1 och SOX2 förmodade förstärkare är kända hotspots för association av flera DNA-bindande proteiner i hESCs. För att förstå om vissa transkriptionsfaktorer berikas i POU5F1–och SOX2-förstärkarinteraktiva regioner analyserade vi systematiskt ChIP-Seq-profiler av 32 DNA-bindande proteiner i hESCs (se metoder). Normaliserade ChIP-Seq tag räknas runt mitten av 4C samverkande platser beräknades och visualiserades med hjälp av boxplot ( figur 7A ). Som en kontroll beräknades också räkningarna runt mitten av de slumpmässiga platserna i de tidiga DNA-replikationsområdena. Statistisk analys identifierade ATF3 -, CTCF -, GABPA -, JUND -, NANOG -, RAD21-och YY1-platser var de mest berikade proteinerna i båda förstärkarinteraktomerna jämfört med kontrollen (P < 0.01, oparat Wilcox rank-sum-test). Pluripotensrelaterad transkriptionsfaktor OCT4 berikas emellertid inte i antingen POU5F1 eller SOX2-interaktom. Därför är ATF3, CTCF, GABPA, JUND, NANOG, RAD21 och YY1 de karakteristiska proteinerna i POU5F1 och SOX2 enhancer interaktomer i hESCs och deras närvaro kan vara funktionellt viktigt.
(a) Boxplots av olika DNA-bindande proteiner runt förstärkarens interagerande platser och slumpmässiga platser (från tidiga DNA-replikeringsområden). ChIP-Seq-taggar inom 5 kb från en interagerande plats räknades och normaliserades. (B) RAD21 samlokaliserar med andra transkriptionsfaktorer i interaktomerna. Genomsnittliga intensitetsprofiler runt rad21 toppplatser i POU5F1 och SOX2-interaktomer i hESCs plottas för transkriptionsfaktorer ATF3, CTCF, GABPA, JUND, NANOG och YY1.
RAD21 är potentiellt i komplex med andra transkriptionsfaktorer för att förmedla förstärkarinteraktomerna
som visas i Figur 7A är RAD21 ett av de berikade proteinerna identifierade i POU5F1-och SOX2-förstärkarinteraktomer i hESCs. RAD21 är en del av ett sammanhållningskomplex som kallas en DNA-kedjans tvärbindare. Cohesin har visat sig förmedla looping av pou5f1 distal enhancer med Pou5f1 genpromotorn i mus ES-celler40. I överensstämmelse med en tidigare rapport som Rad21 samarbetar med Ctcf och andra transkriptionsfaktorer för att upprätthålla mus ES-cellidentitet40, rad21-platser i både POU5F1 och SOX2-interaktomer i hESCs är samtidigt upptagna av transkriptionsfaktorer. Aggregeringsdiagram illustrerar tydligt toppsignalerna för ATF3 -, CTCF -, GABPA -, JUND -, NANOG-och YY1-bindningsprofiler i mitten av RAD21-platser i pou5f1-och SOX2-interaktomer ( figur 7B ). Knockdown av Gabpa i mus ES-celler är känt för att minska oct3/4-uttryck, medan överuttryck av Gabpa upprätthåller uttryck av Oct3 / 4 även utan LIF i mus ES-cellkultur41. I en genomomfattande siRNA–skärm i hESCs38 minskade knockdown av de flesta berikade proteinerna, såsom RAD21, CTCF, GABPA, JUND, NANOG och YY1, signifikant uttrycket av en transgen POU5F1-promotor kopplad till en GFP-reporter, med Fav-värden på -1.50421, -1.05828, -1.44161, -1.07731, -1.82749, -2.57204, respektive (inom de översta 25% av alla generna som screenas). För att ytterligare förstå kromatin-kromatininteraktionerna tillämpade vi DNA-fluorescerande in-situ hybridisering (FISH) för att visualisera samlokalisering av två genomiska loci på enkelcellsnivå. Rarg-genlokusen på kromosom 12 har identifierats i pou5f1-interaktomen i hESCs. RARG visade sig nyligen spela en mycket viktig roll i pluripotency och kan förbättra IPS-cellinduktion med två magnituder42. En annan plats på kromosom 12 som inte ingår i pou5f1-interaktomen användes som kontroll. Samlokaliseringsfrekvensen mellan RARG-locus (chr12: 51751589-51956291) och POU5F1 locus (chr6: 31169844-31340561) befanns vara 1,67 gånger högre än frekvensen mellan kontrolllokalen (chr12: 80380971-80564119) och POU5F1 locus (9,35% mot 5,61%, P < 0,05, kompletterande Fig. 3A). Den högre kontaktfrekvensen mellan rarg och POU5F1 loci överensstämmer med våra sekvenseringsdata och antyder att mer stabila interaktioner bildas mellan de två loci. Undersökning av rarg-och kontrolllokalerna (kompletterande Fig. 3B) avslöjade att det finns mer RAD21 och andra transkriptionsfaktorbindningsställen i RARG-locus med frekvent samlokalisering. Sammanträffande av kromosominteraktionsfrekvens med RAD21-innehållande bindningsställen för multipla transkriptionsfaktorer antyder att RAD21 kan samarbeta med andra transkriptionsfaktorer för att organisera långväga kromatin-kromatin-interaktioner. Således är RAD21, tillsammans med flera transkriptionsfaktorer, sannolikt att bidra till högre ordningens kromosomstruktur kring POU5F1 och SOX2 förstärkare i hESCs som en del av ett pluripotensnätverk. Emellertid behövs ytterligare molekylära studier för att bekräfta denna hypotes härledd från 4C-Seq-studien.