- Abstrakt
- 1. Introduktion
- 2. Material och metoder
- 2.1. Djur
- 2.2. Cellkulturer
- 2.3. Immunofluorescensfärgningsanalys
- 2.4. Western Blot
- 2,5. Kvantitativ (realtid) polymeraskedjereaktion (realtid PCR)
- 2.6. Statistisk analys
- 3. Resultat
- 3.1. Fördelningen av astrocyter märkta med NDRG2, GFAP, och S100 Cu i olika cerebrala regioner
- 3.2. Morfologierna för astrocyter märkta med NDRG2, GFAP och S100 kg i olika hjärnregioner
- 3.3. Colocalization av NDRG2, GFAP och S100 kg inom astrocyter i olika cerebrala regioner
- 3.4. Uttrycket av Ndrg2 -, GFAP-och S100-proteiner i olika hjärnregioner
- 4. Diskussion
- datatillgänglighet
- Disclosure
- intressekonflikter
- författarnas bidrag
- bekräftelser
- kompletterande material
Abstrakt
astrocyter har olika morfologiska egenskaper beroende på hjärnområdet där de finns. Ingen av de nuvarande astrocytiska markörerna kan emellertid märka alla subpopulationer framgångsrikt. Att identifiera lämplig markör för en specifik vetenskaplig undersökning är således kritisk. Här jämförde vi fördelningen och proteinuttrycket av tre astrocytmarkörer: NDRG2, GFAP, och S100 msk, i cortex, hippocampus, och thalamus. Ndrg2-och S100-positiva astrocyter fördelades mer enhetligt än GFAP-positiva astrocyter genom hela hjärnan. Ndrg2-och S100-Seki-immunoreaktiviteten var den starkaste i dorsal cortex och thalamus, medan GFAP-immunoreaktiviteten var den starkaste i hippocampus. Dessutom var proteinexpressionsnivåerna av NDRG2, GFAP och S100 kg hos vuxna möss de högsta i cortex, hippocampus respektive thalamus. Vi upptäckte också astrocytmorfologi och fann att i corpus callosum och cerebral peduncle hittades GFAP-positiva astrocyter med mer talrika och längre processer än Ndrg2 – och S100 kg-positiva astrocyter. Dessa resultat visar att Ndrg2 och S100 kg är mer lämpligt används för att visualisera den totala fördelningen och förändringar i antalet astrocyter, samt etikett astrocyter i cortex och thalamus. GFAP används emellertid mer lämpligt för att märka astrocyter i corpus callosum, cerebral peduncle och hippocampus. Dessa resultat hjälper till att vägleda forskare i valet av lämplig astrocytmarkör och föreslå skillnader i immunologiska egenskaper hos astrocyter baserat på vävnaden där de finns.
1. Introduktion
astrocyter har länge ansetts vara hjälpceller som endast ger trofiskt, metaboliskt och strukturellt stöd till neuroner . Men under de senaste åren har omfattande forskning visat att de spelar avgörande roller i cerebrala fysiologiska och patologiska funktioner. Astrocyter hjälper till att upprätthålla jonhomeostas och blod-cerebrala barriärer, synapsbildning och borttagning, samt att kontrollera cerebralt blodflöde och reglera återvinning av neurotransmittor, glutamat excitotoxicitet och antioxidantstress . Det är viktigt att astrocyter har morfologiska, populations-och funktionella mångfald i olika hjärnregioner . Därför är identifiering av den mest lämpliga markören för de polymorfa och multipla undergrupperna av astrocyter avgörande för forskning om astrocytisk multifunktion.
Glial fibrillärt surt protein (GFAP) är den vanligaste astrocytiska markören, men som den huvudsakliga mellanliggande filamentet som komponerar cytoskelettet, immunmärkte GFAP endast cirka 15% av den totala astrocytvolymen och mer än 40% av astrocyterna befanns vara GFAP-negativa hos den vuxna råtthippocampus . Dessutom märktes GFAP protoplasmiska humana astrocyter dåligt och uttrycktes sent i utvecklingen av fibrösa astrocyter .
en annan vanligt använd astrocytisk markör är S100 msk, en Ca2 + bindande peptid som är riklig i cytoplasman och kärnan i astrocyter som är involverade i cellcykelreglering och cytoskeletonmodifiering . Emellertid uttrycks S100 kcal också i en subpopulation av mogna oligodendrocyter, i choroid plexus epitelceller och i några få neuroner . Bristerna i GFAP och S100 SEK i märkning av astrocyter kan leda till felaktigheter eller till och med misstag vid utforskning av astrocyternas funktioner.
N-Myc nedströmsreglerad Gen 2 (NDRG2) upptäcktes först i ett normalt humant cerebralt cDNA-bibliotek med en PCR-baserad subtraktiv hybridiseringsmetod . Det är en tumörsuppressor och cellstressrelaterad gen associerad med cellproliferation och differentiering . NDRG2 uttrycks allmänt i hjärnbarken, olfaktorisk glödlampa, midcerebral, hippocampus och thalamus . Viktigast är NDRG2 specifikt uttryckt i astrocyter i hjärnan . Således betraktas NDRG2 som en ny astrocytisk markör, särskilt för mogna, icke-reaktiva och icke-spridande astrocyter . Huruvida NDRG2 är mer tillförlitlig än GFAP och S100 kcal som en astrocytisk markör, liksom skillnaderna i deras fördelning och uttryck i olika cerebrala regioner, har dock inte rapporterats.
i den aktuella studien jämförde vi fördelningen, proteinuttrycket och den ömsesidiga kolokaliseringen av astrocytiska markörer NDRG2, GFAP och S100 kcal genom hela hjärnan hos möss. Vi syftade till att identifiera den mest lämpliga markören för astrocyter i olika hjärnregioner.
2. Material och metoder
2.1. Djur
unga, vuxna och gamla C57BL / 6 hanmöss i åldern 1 månad, 3 månader, 6 månader, 9 månader och 12 månader erhölls från Experimental Animal Center vid Central South University. Djuren var fria att äta och dricka, hölls vid en temperatur av 25 2CG 1CG C, och inrymt med en 12:12-h ljus-mörk cirkel för att simulera djurets dygnsrytm. Alla ansträngningar gjordes för att minimera djurens lidande och minska antalet djur som används. Alla djurförsök följde ett protokoll som godkänts av etiska Utskottet för djurförsök av Central South University Animal Care and Use Committee, Kina.
2.2. Cellkulturer
ht22-cellerna (en neuronal cellinje) och MA1800-57-celler (en astrocytcellinje) odlades i Dulbeccos modifierade Eagle ’ s Medium (DMEM, Hyklon) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS, Gibco), 50 U/mL penicillin och 50 uccyg/mL streptomycin. OLN-93-cellerna (en oligodendroglialcellinje) förvarades i DMEM kompletterat med 10% FBS, 2 mM Glutamin, 50 U/mL penicillin och 50 kg/mL streptomycin. Cellerna bibehölls alla vid 37 C i en blandning av 95% atmosfärisk luft och 5% CO2. Ht22-cellerna, OLN-93-cellerna och ma1800-57-cellerna såddes på objektglas och färgades med antikroppar mot mikrotubuli-associerat protein 2 (MAP2), Baccarat-tubulin respektive GFAP.
2.3. Immunofluorescensfärgningsanalys
Efter att mössen bedövades med natriumpentobarbital (50 mg/kg) extraherades deras cerebrums och fixerades med 0,9% kall hepariniserad saltlösning och 4% paraformaldehyd. Efter postfixering dehydratiserades cerebrummen successivt i 20% sackaros och 30% sackaroslösningar. Sektioner med en tjocklek på 10 oz. m bereddes med en Leica cm1900 fryst skivare. De cerebrala sektionerna inkuberades i 1% H2O2 i 15 minuter och 0,3% Triton X-100 i 15 minuter, med 3 kg tvättar i PBS postinkubation mellan varje behandling. Sektionerna blockerades sedan i 5% normalt getserum i 1 h vid rumstemperatur och inkuberades över natten vid 4 kg C i en befuktningslåda med primära antikroppar enligt följande: mus anti-GFAP-antikropp (#3670, 1:500, Cellsignaleringsteknik); kanin anti-NDRG2-antikropp (#5667, 1:200, Cellsignaleringsteknik); mus Anti-NDRG2-antikropp (#DA281-6A5, 1:100, Sigma); kanin anti-S100#2017-1, 1:500, epitomics); mus-anti-glutaminsyntetas (GS) antikropp (#mab302, 1:200, Millipore); kanin-anti-MAP2-antikropp (#ab32454, 1:500, abcam); och mus-anti-tubulin-antikropp (#t6199, 1:500, Sigma). Därefter inkuberades sektionerna med blandningar av Alexa-488 (grön, Invitrogen) och Alexa-647 (röd, Invitrogen)-konjugerade donkey anti-rabbit eller donkey anti-mouse sekundära antikroppar för 2 h i mörkret vid rumstemperatur. 4,6-Diamidino-2-fenylindol (DAPI) (ZLI-9557, Zsbio) användes för att fläcka kärnor. Sektionerna monterades med 50% glycerol. Slutligen sågs och fotograferades sektionerna med hjälp av ett Olympus bx51 (Japan) fluorescensmikroskop. Antikropparna som användes i vår studie användes i stor utsträckning i våra tidigare studier och av andra utredare , och känsligheten och specificiteten hos dessa antikroppar har bekräftats.
2.4. Western Blot
cortex, hippocampus och thalamus samlades in från C57BL/6 möss i åldern 1 månad, 3 månader, 6 månader, 9 månader och 12 månader. Proverna homogeniserades i RIPA-buffert och koncentrationen av proteinproverna mättes med BCA-Proteinanalyssats (Pierce Biotechnology, US). Proteinproverna separerades med 10% SDS-PAGE (SDS-PAGE Gel kit, CW0022S, Kina) och överfördes elektriskt till polyvinylidendifluorid (PVDF) membran. Komponenterna i SDS-PAGE Gel kit inkluderade en 30% Acr-Bis, SDS-PAGE separerande Gelbuffert, SDS-PAGE stapling Gelbuffert, APS (ammoniumpersulfat) och TEMED (N, N, N’, N’-tetrametyletylendiamin). Därefter blockerades membranen i 5% icke-fet torrmjölk utspädd i TBST (TBS med 0, 05% Tween 20) under 1 h vid rumstemperatur och inkuberades sedan med specifika primära antikroppar: mus anti-GFAP-antikropp (#3670, 1:1000, Cellsignaleringsteknik); kanin anti-NDRG2-antikropp (#5667, 1:1000, Cellsignaleringsteknik); kanin anti-S100-antikropp (#2017-1, 1:1000, Epitomics); och kanin-anti-GAPDH-antikropp (#5174, 1:1000, Cellsignaleringsteknik) över natten vid 4 kg C. membranen inkuberades sedan med en HRP-konjugerad sekundär anti-kanin eller anti-musantikropp (Thermo Scientific, USA) för 2 h. Kemiluminescerande signaler utvecklades med hjälp av Western Lightning chemiluminescence reagent plus (PerkinElmer life sciences; Wellesley, MA) och detekteras av en bildanalysator LI-COR Odyssey-System (LI-COR Biotechnology, USA). Immunoreaktiviteten hos proteinband analyserades kvantitativt med Bio-Rad-Bildlabbet-programvara för bildlabb. Banddensitetsvärden normaliserades till GAPDH.
2,5. Kvantitativ (realtid) polymeraskedjereaktion (realtid PCR)
cortex, hippocampus och thalamus samlades in från C57BL/6 möss i åldern 1 månad, 3 månader, 6 månader, 9 månader och 12 månader. Totalt RNA isolerades med användning av ett TransZol Up Plus RNA-Kit(kod nr. Er501-01, Transgen, Kina) och kvantifieras med användning av en NanoDrop 2000. Därefter transkriberades 1000 ng av totalt RNA omvänd i en 20 oC-reaktion vid 42 CCB i 15 min, följt av 85 CCB i 5 SEK Med hjälp av en Transscript-allt-i-ett-första-sträng cDNA-syntes SuperMix för qPCR (kod nr. AT341, Transgen, Kina). Komponenterna i kitet inkluderade en TransScript-allt-i-ett-Supermix för 5-i-ett-supermix för qPCR (transscript-rt, Rnashämmare, förankrad Oligo(dT)18-Primer, slumpmässig Primer(N9), dntps, buffert), en 5-i-ett-Transscript-allt-i-ett-Supermix för qPCR, en gDNA-Remover och ett RNase-fritt vatten. TransScript-allt-i-ett-Supermix utan RT-kontroll för qPCR i 5-år användes som en negativ kontroll. Realtids-PCR utfördes i en 20 oC-reaktion enligt tillverkarens manual för TransStart Tip Green qRNA SuperMix(kod nr. AQ141, Transgen, Kina). De använda mRNA-primersekvenserna finns i Tabell 1. Reaktionen utfördes vid 94 kg C i 30 sek följt av 40 cykler av 94 kg C i 5 sek, 60 kg C i 15 sek och 72 kg C i 19 sek på ViiA7 realtids-PCR-detekteringssystem (2720 termisk cykler, applicerade biosystem). Primrarna och sekvenserna härledda från det relativa mRNA-uttrycket analyserades med användning av formeln .
|
||||||||||||||||||||||||
2.6. Statistisk analys
statistiska tester utfördes med användning av PRISM v7.0 programvara (GraphPad). Jämförelser mellan två grupper utfördes med hjälp av studentens t-test. Jämförelser mellan olika grupper utfördes med envägs ANOVA med Tukeys posttest. Alla värden presenterades som det genomsnittliga SD-värdet för Xiaomi. Värden på p<0,05 ansågs statistiskt signifikanta.
3. Resultat
3.1. Fördelningen av astrocyter märkta med NDRG2, GFAP, och S100 Cu i olika cerebrala regioner
regionerna hos möss cerebra identifierades genom märkning av cellkärnorna. Dessutom användes en motsvarande mushjärnaatlas för att verifiera de analyserade specifika regionerna (Figur 1). Vi använde sedan immunofluorescensfärgning för att detektera fördelningen av astrocyter märkta med NDRG2, GFAP och S100 kg i olika cerebrala regioner hos vuxna hanmöss i åldern 6 månader. Ndrg2-och S100-positiva astrocyter var rikligare och jämnare fördelade än GFAP-positiva astrocyter genom hela hjärnan (Figur 2). Ndrg2-positiva astrocyter koncentrerades i dorsal cortex (Region 1) och thalamus (Region 5), men mindre i hippocampus (Region 4), corpus callosum (Region 3) och ventral cortex (Region 2) och minst i cerebral peduncle (Region 6) (figurerna 2(A) och 2 (b)). GFAP-positiva astrocyter koncentrerades mest i hippocampus; mindre detekterades i corpus callosum och cerebral peduncle och nästan odetekterbar i dorsal cortex, ventral cortex och thalamus (figurerna 2(A) och 2(c)). S100-positiva astrocyter koncentrerades mest i dorsal cortex och thalamus, mindre i hippocampus och ventral cortex, och minst av allt i cerebral peduncle och corpus callosum (figurerna 2(b) och 2(c)). Fördelningen av de NDRG2-positiva astrocyterna liknade den för de S100 kg-positiva astrocyterna.
(a)
(b)
(a)
(b)
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
astrocyter i olika cerebrala regioner presenterade ojämförliga immunoreaktiviteter mot NDRG2, GFAP och S100 kcal (Figur 2). Astrocyter i dorsal cortex och thalamus reagerade starkt på NDRG2, och S100 kcal, men svagt till GFAP. Astrocyter i hippocampus reagerade starkt på GFAP och måttligt på NDRG2 och S100 kcal. Astrocyter i den ventrala cortexen, corpus callosum och cerebral peduncle reagerade svagt till måttligt till NDRG2, GFAP och S100 kcal (Tabell 2).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
+++: starkt positiv; ++: måttligt positiv; +: svagt positiv.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
fördelningen av astrocyter märkta med NDRG2, GFAP och S100 kcal i olika cerebrala regioner hos hanmöss liknade den hos gamla hanmöss (12 månader) (Figur 3).
3.2. Morfologierna för astrocyter märkta med NDRG2, GFAP och S100 kg i olika hjärnregioner
astrocyter är huvudsakligen indelade i två typer: fibrösa astrocyter i vit substans och protoplasmiska astrocyter i grå substans. Därför jämförde vi morfologierna för de två typerna märkta med olika markörer i corpus callosum (vit substans, Region 3) och hippocampus (grå substans, Region 4) (Figur 4). Resultaten från vuxna hanmöss (6 månader) visade att ndrg2 – och S100 kg-positiva astrocyter presenterade en stellatform kännetecknad av stor och rund soma tillsammans med korta och grova cytoplasmatiska processer som hade få grenar. De GFAP-positiva astrocyterna presenteras med en radiell form som kännetecknas av små Soma, långa processer och multigrenar (Figur 4). Dessutom, i corpus callosum och cerebral peduncle, presenterade astrocyterna märkta med GFAP med mer rikliga längre processer än de märkta med NDRG2 och S100 kcal (figurerna 5 och 7).
3.3. Colocalization av NDRG2, GFAP och S100 kg inom astrocyter i olika cerebrala regioner
NDRG2 var nästan colocalized med GFAP i astrocyter av ventral cortex, corpus callosum och cerebral peduncle, och mestadels colocalized med GFAP i astrocyter av hippocampus (figurerna 5 och 8(A)). NDRG2 hade nästan ingen kolokalisering med GFAP i astrocyter i dorsal cortex och thalamus (Figur 5). Ndrg2 och S100 kcal presenterade nästan fullständig kolokalisering i astrocyter i de sex hjärnregionerna(figurerna 6 och 8 (b)). GFAP och S100 kg presenteras med betydande colocalization i astrocyter i ventrala cortex, corpus callosum, och cerebral peduncle och nästan fullständig colocalization i astrocyter i hippocampus (Figur 7). GFAP och S100 IC hade nästan ingen colocalization i astrocytes av den dorsal cortexen och thalamus (figurera 7).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
vi upptäckte också kolokalisering av NDRG2 och en annan astrocytisk tillverkare, glutaminsyntetas (GS), i astrocyter av mösshjärnan. NDRG2 och GS hade signifikant kolokalisering i astrocyter (figur s1a). NDRG2 och GS presenterade grundlig kolokalisering i fibrösa astrocyter av corpus callosum och i protoplasmiska astrocyter av hippocampus (figur s1b). Ndrg2-proteinuttryck i neuronal cellinje HT22-celler, oligodendroglialcellinje OLN-93-celler och astrocytisk cellinje MA1800-57-celler detekterades också (figur s2). Ndrg2-protein detekterades i ma1800-57-celler och detekterades knappt i HT22-celler och OLN-93-celler (figurerna s2a och s2b).
3.4. Uttrycket av Ndrg2 -, GFAP-och S100-proteiner i olika hjärnregioner
Vi använde western blotting för att detektera uttrycksnivåerna för ndrg2 -, GFAP-och S100-proteiner i tre cerebrala regioner hos vuxna hanmöss (6 månader): cortex, hippocampus och thalamus (figur 8(c)). Vi analyserade uttrycksnivåerna för dessa markörer i samma hjärnregion (figur 8(d)). I cortex var nivån på ndrg2-uttryck markant högre än GFAP-och S100-expressionsnivåer (p<0.001, p<0.05). Expressionsnivån för S100 GHz var också mycket högre än GFAP (p<0,05). I hippocampus var nivån på GFAP-uttryck högre än NDRG2 och S100 GHz (p<0.01), och nivån på ndrg2-uttryck var lite mindre än S100-Uttrycksnivån för S-Uttryck, även om skillnaden inte var statistiskt signifikant. I thalamus var expressionsnivån för S100 GHz signifikant högre än GFAP-och ndrg2-uttrycksnivåer (p<0,01), medan nivån på ndrg2-uttryck liknade den för GFAP.
därefter analyserade vi uttrycksnivåerna för samma markör i olika hjärnregioner (figur 8(e)). Nivån av ndrg2-uttryck i cortexen var mycket högre än i hippocampus och thalamus (p<0,01), och ingen signifikant skillnad observerades mellan hippocampus och thalamus. Nivån av GFAP-uttryck i hippocampus var den högsta bland de tre regionerna (p<0.001, p<0.01); ingen signifikant skillnad observerades mellan cortex och thalamus. Nivån på S100-uttrycket i talamus var signifikant högre än i cortex och hippocampus (p<0.01), utan någon signifikant skillnad observerad mellan de två senare.
vi upptäckte också proteinnivåerna av NDRG2, GFAP och S100 kcal i cortex, hippocampus och talamus hos hanmöss i åldern 1 månad, 3 månader, 6 månader, 9 månader och 12 månader (figurerna 9(a)-9(f)). Proteinnivåerna av NDRG2 och GFAP i cortex, hippocampus och thalamus ökade gradvis med åldern (p<0,05, p<0,01). Proteinnivåerna av S100 msk i cortex och thalamus, men inte i hippocampus, ökade gradvis med åldern (p <0.05, p<0,01, p<0,001). MRNA-nivåerna av NDRG2, GFAP och S100 kcal i cortex, hippocampus och talamus hos hanmöss i åldern 1 månad, 3 månader, 6 månader, 9 månader och 12 månader överensstämde med proteinnivåerna (p<0.05, p<0.01, figurerna 9(g)-9(i)).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
4. Diskussion
i den här studien fann vi att astrocyter märkta med NDRG2 och S100 kcal fördelades mer brett och enhetligt än de som märktes av GFAP i hela hjärnan hos unga, mogna och gamla möss. Detta tyder på att Ndgr2 och S100 kg är mer lämpliga markörer för att observera den totala fördelningen och antalet förändringar av astrocyter. Dessutom visade våra resultat att astrocyter i olika hjärnregioner presenterade olika nivåer av immunreaktivitet mot NDRG2, GFAP och S100 kg, vilket tyder på att NDRG2 och S100 kg i cortex och thalamus är mer lämpliga astrocytiska markörer än GFAP. Den ojämförliga immunoreaktiviteten hos astrocyter till NDRG2, GFAP och S100 kg kan också bero på känsligheten och specificiteten hos antikropparna vi använde. Dessutom liknade morfologierna hos astrocyter märkta med NDRG2 och S100 kg varandra, men skilde sig uppenbarligen från de som märktes av GFAP eftersom dessa markörer märkte olika cytoskeletala strukturer. NDRG2 fläckar cytoplasman och cellmembranen och fläckar svagt kärnan . GFAP färgar huvudsakligen soma och processer, men inte kärnan, medan S100 kcal fläckar kärnan och en del av cytoplasman och processerna . Genom att jämföra morfologierna hos astrocyter märkta med NDRG2, GFAP och S100 kcal fann vi att GFAP var en mer lämplig markör för astrocyter i corpus callosum, cerebral peduncle och särskilt hippocampus. Proteinerna NDRG2 och S100 kcal uttrycktes mest i cortex respektive thalamus. Vi drar slutsatsen att NDRG2 är mer lämplig för astrocyter i cortexen medan S100 kcal är mer lämplig för astrocyter i thalamus när man kvantifierar astrocytisk densitet. De olika proteinuttrycksmönstren för NDRG2, GFAP och S100 kcal i cortex, hippocampus och thalamus bekräftade astrocytisk funktionell heterogenitet.
astrocyter har visat sig spela en viktig roll vid upprätthållandet av homeostas, och de deltar aktivt i nästan alla neurologiska störningar, såsom ischemiska stroke, traumatiska hjärnskador, Alzheimers sjukdom och Parkinsons sjukdom . Det har visats att astrocytisk morfologi, genuttryck och funktion skilde sig mellan olika regioner i hjärnan . Fibrösa astrocyter och protoplasmiska astrocyter är två stora subpopulationer identifierade av deras morfologi . Fibrösa astrocyter har långa, tunna processer och ett stjärnliknande utseende, medan de protoplasmiska har många fina processer, som kommer i kontakt och mantelsynapser . Intressant nog uttrycks många gener heterogent av delmängder av astrocyter. Dessa gener kodar proteiner såsom glutamattransportörer och jonkanaler , såväl som glutamat -, dopamin-och opioidreceptorer .
heterogeniteten av genuttryck innebar den funktionella mångfalden av astrocyter. Till exempel skiljer sig glutamatupptag mellan olika delmängder . Dessutom skiljer sig spontana kalciumoscillationer mellan olika lager av somatosensorisk cortex. Kortikala lager 1 astrocyter visade frekvent asynkron Ca2 + – aktivitet, medan lager 2/3 astrocyter visade sällsynt synkron Ca2+ – aktivitet . I cortexen svarar astrocyter på glutamat och noradrenalin med ökningar av kalcium, medan hippocampala astrocyter uppvisar kalciumsvar på ATP, GABA, glutamat, acetylkolin, prostaglandiner och endokannabinoider . Studier har också visat att Odlade astrocyter från olika hjärnregioner har olika kapacitet att stimulera neurittillväxt och förgrening . Eftersom astrocyter i olika hjärnregioner uppvisar olika egenskaper hos morfologi och funktion är det avgörande för astrocytiska forskare att identifiera den mest lämpliga markören för astrocyter i olika hjärnregioner.
även om flera proteiner har rapporterats som selektivt uttryckta av astrocyter, har ingen visats vara helt begränsad till alla astrocytiska subtyper. GFAP, den mest använda astrocytiska markören, uttrycks företrädesvis i astrocyter av vit materia över gråämnen och misslyckas med att märka alla processer av astrocyter . Ännu viktigare är att det finns delmängder av GFAP-negativa astrocyter som presenterar spänningsberoende K+-strömmar, medan de GFAP-positiva astrocyterna presenterar det klassiska mönstret av tids – och spänningsoberoende strömmar .
tidigare studier har visat att S100 oc kunde märka astrocyter i både grå och vit substans; emellertid uttrycktes det också i några oligodendrocyter och neuroner . S100 kg visade sig uttryckas mest i talamus astrocyter, en subtyp av celler som deltar i rengöringen av DAergic skräp som produceras genom degenerering av DAergic terminaler i Parkinsons sjukdom genom att underlätta närvaron av lysosomer och bildandet av autofagosomer . Den transkriptomiska analysen av astrocyter identifierade aldehyddehydrogenas 1-familjen, medlem L1 (ALDH1L1), som en astrocytisk markör . ALDH1L1 märkte emellertid också oligodendrocyter . På liknande sätt hade de excitatoriska aminosyratransportörerna glutamat/ASPARTATTRANSPORTÖREN (GLAST), glutaminsyntetas (GS), glutamatransportören-1(GLT-1), vimentin, connexin 43, aquaporin 4 och cellytan glykoprotein CD44 också begränsningar vid märkning av astrocyter .
NDRG2 uttrycks specifikt i astrocyter hos både råttor och möss och är associerad med tillväxten och mognaden av den utvecklande embryonala hjärnan . Förutom cellproliferation, differentiering och transmembrantransporter deltar NDRG2 också i stressresponser, depression, ischemiska sjukdomar och neurodegenerativa störningar . Hos möss och människor deltar NDRG2 i utvecklingen av attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD), en sjukdom associerad med lokomotionscentret i hjärnbarken . Flugge et al. detekterade uttrycket av NDRG2 i cerebrums av människor, marmosets, trädskruvar, råttor och möss, och föreslog NDRG2 var en ny astrocytisk markör, speciellt för mogna, icke-reaktiva och icke-spridande astrocyter . I denna studie upptäckte vi först fördelningsmönstret för NDRG2-positiva astrocyter i olika hjärnregioner och skillnader med astrocyterna märkta med klassiska markörer GFAP och S100 kcal.
astrocyter och astrocytiska markörer förändrades under normal hjärnåldring. Tidigare arbete har visat att astrocyter aktiveras tidigt i åldrandet, och den signifikanta ökningen av GFAP-positiva astrocyter hittades i hippocampala regioner hos åldrade möss . Nivåerna av både GFAP-protein och GFAP-mRNA ökade i olika delar av åldrande hjärnor, såsom hjärnbarken, hippocampus och cerebellum . Skillnader finns kvar bland olika rapporter om S100 kcal i den åldrande hjärnan . I allt högre grad har studier visat att NDRG2 är associerad med åldersrelaterade störningar såsom Alzheimers sjukdom. I vår studie ökade nivåerna av GFAP och ndrg2-mRNA i cortex, hippocampus och thalamus gradvis med åldern, medan nivåerna av S100-mRNA i hippocampus och thalamus ökade med åldern, men inte i cortex.
Vi bör notera att för närvarande används många markörer utöver de vi testade, såsom ALDH1L1, GLAST, GLT-1, CD44 och vimentin för att märka astrocyter. I vår studie jämförde vi bara de klassiska cerebrala astrocyterna märkta med den nya föreslagna markören NDRG2 och de mest använda markörerna: GFAP, S100 OC i hjärnan och GS i hjärnan.
Sammanfattningsvis visar vår studie att Ndrg2 och S100 kg är mer lämpliga markörer för astrocyter i cortex respektive thalamus, liksom för att observera den totala fördelningen och förändringar i antalet astrocyter i hela hjärnan. Under tiden är GFAP överlägset NDRG2 och S100 VIII vid märkning av processer och grenar av astrocyter i corpus callosum, cerebral peduncle och särskilt hippocampus. Vår studie visar vikten av att välja den mest lämpliga markören för astrocyter i olika cerebrala musregioner, vilket ger vägledning för neurovetenskapsforskare när de utforskar astrocytiska funktioner.
datatillgänglighet
de data som används för att stödja resultaten av denna studie ingår i artikeln.
Disclosure
Zengli Zhang och Zhi Ma är de första författarna.
intressekonflikter
författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
författarnas bidrag
Zengli Zhang och Zhi Ma bidrog lika till denna studie.
bekräftelser
detta arbete stöddes av Beijing Natural Science Foundation (nr 7194321 till Lixia Zhang), National Natural Science Foundation of China (nr 81801138 till Yulong Ma, nr 81771206 till Wangyuan Zou), Young Scholar Research Grant of Chinese Anesthesiologist Association (nr 21700001 till Yulong Ma), Miaopu Foundation of Chinese Anesthesiologist Association (nr 21700001 till Yulong Ma), The Miaopu Foundation of Chinese Anesthesiologist Association (nr 21700001 till Yulong Ma), The Miaopu Foundation of Chinese PLA General Hospital (nr. 18kmm47 till Lixia Zhang), och Peking kommunala vetenskap & Technology Commission (nr 1811000017180022 att hänga Guo).
kompletterande material
kompletterande Figur 1. Kolokaliseringen av NDRG2 och GS inom astrocyter. Kompletterande Figur 2. Uttrycket av ndrg2-protein i cellinjer. (Kompletterande material)