4.3 BBB-korsning bsAbs konstruerad med enkeldomänantikroppar
sdAbs är små (15 kDa), monomera antigenbindande fragment av antikroppar som ger olika fördelar jämfört med andra antikroppsfragment som ”byggstenar” för bsAbs. De förekommer i naturen som den antigenbindande delen av tunga kedjeantikroppar i kamelidarter (kallad VHH) och broskfisk (kallad VNAR) eller kan genereras från konventionella IgGs genom att erhålla eller konstruera monomera, stabila VH-eller VL-domäner (Hamers-Casterman et al., 1993; Hussack et al., 2012; Kim et al., 2014; Nuttall, 2012; Ward, g Aubbissow, Griffiths, Jones, & vinter, 1989). sdAbs är mycket stabila och kompakta och de kan komma åt infällda epitoper i proteiner, såsom receptorhåligheter eller de aktiva platserna för enzymer, som ofta är ”dolda” från konventionella IgGs och kan uppnå målbindningsaffiniteter jämförbara med konventionella antikroppar (Lauwereys et al., 1998; Staus et al., 2014). Dessa monomera antigenbindande enheter parar inte med lätta kedjor, vilket gör dem till utmärkta byggstenar för heterodimeriserade bsAbs eftersom de undviker svårigheter med felaktig parning av lätta kedjor (Hamers-Casterman et al., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). Heterodimera bsAbs kan skapas med en eller båda” armarna ” som sdAb, den senare är liknande i struktur till camelid tungkedjiga antikroppar (Fig. 3E). sdAbs kan också användas i olika mono-, bi-eller tetravalenta fusioner med konventionella terapeutiska antikroppar eller Fabs (Fig. 3e), vilket i allmänhet resulterar i mindre, mindre komplexa molekyler, jämfört med de som genereras med scFvs eller Fabs som byggstenar, som tenderar att vara biofysiskt väluppfostrade och lätta att producera (Holliger & Hudson, 2005). Humanisering av VHHs såväl som konstruktion av sdAbs beskrivs väl, vilket gör det möjligt att enkelt generera mänskliga(ized) sdAbs med optimal målaffinitet och exceptionella biofysiska egenskaper (Vincke et al., 2009).
för att utvärdera den potentiella användningen av camelid VHH FC5 som en BBB-bärare inom bispecifika CNS – riktade antikroppar, monovalenta och bivalenta fusioner (N-och C-terminus) av FC5 med human Fc designades och utvärderades in vitro och in vivo (Farrington et al., 2014). Skenbar bindningsaffinitet (Kdapp) till råttbec för den bivalenta fc5fc-fusionen var 75 nM, medan monovalent fc5fc-bindning var i det mikromolära området. Analyserna av uppenbara transmigrationshastigheter (Papp) över en in vitro BBB-modell, uppenbar CNS – exponering härledd från serum/CSF-farmakokinetik för systemiskt administrerade antikroppskonstruktioner och farmakologiska svar som framkallats av kemiskt konjugerade BBB-ogenomträngliga neuroaktiva peptider i Hargreaves smärtmodell, gav bevis för förbättrad BBB-transport av dessa stora (75 kDa) antikroppsmolekyler medierade av FC5: (1) in vitro papp-värden var ~ 200 cm/min för både mono-och bivalenta N-terminala Fc-fusionsmolekyler (FC5Fc) jämfört till 4-8 cm/min för kontroll VHH A20.1FC-eller EG2Fc-fusioner; (2) den uppenbara CNS-exponeringen av fc5fc–fusionen var 30 gånger högre jämfört med kontrolldomänantikropp-Fc–fusioner; (3) systemisk farmakologisk styrka av FC5Fc-konjugat med neuropeptider dalargin eller galanin i Hargreaves inflammatorisk smärtmodell var upp till 60 gånger högre jämfört med monomera FC5-neuropeptidkonjugat. Detta resultat tillskrevs den långa cirkulationshalveringstiden (~ 96 h) för FC5Fc-jämfört med FC5-neuropeptidkonjugat; (4) olika kontroll VHH-Fc neuropeptidkonjugat visade ingen systemisk effekt; (5) fusion av FC5 till Fc: s C-terminal resulterade i försvagad BBB-korskapacitet. Till skillnad från TFR-riktade BBB – bärarantikroppar visade både mono-och bivalenta fc5fc-fusionsproteiner en liknande hastighet av transcytos in vitro, liknande plasma/CSF farmakokinetiska profiler och liknande systemisk potens i farmakodynamikmodellen in vivo, trots skillnader i uppenbar bindningsaffinitet och Valens (Farrington et al., 2014). Dessa studier visade att den BBB-korsande enkeldomänantikroppen FC5 kan användas som en plattform BBB-bärare i båda, heterodimeriserade ”halvantikroppar” och som den lättare skalbara bi – eller tetravalenta fusionen till konventionella IgGs (Farrington et al., 2014).
en annan potentiell fördel med VHHs som BBB-bärare är deras naturliga motståndskraft mot extrema biofysiska utmaningar, såsom temperatur och pH, samt proteasnedbrytning (Kim et al., 2014), som ofta förekommer i olika endocytiska fack under transcytos. Både FC5-och FC5Fc-fusioner internaliseras i BEC via klatrinbelagda vesiklar och sorteras till tidiga endosomer. Intressant, FC5 befanns också stimulera utsöndring av extracellulära mikrovesiklar (exosomer) från BEC (Haqqani, Caram-Salas, et al., 2013; Haqqani, Delaney, et al., 2013) där både FC5 och ökade nivåer av dess förmodade receptor Cdc50A detekterades av Western blot och riktade masspektrometri. Denna studie föreslog att kasta exosomer kan vara den slutliga vesikeln i RMT-vägen som frigörs från den abluminala ytan som bär receptor-antikroppskomplexet (schematiskt visat i Fig. 4). RMT-vägen och exosombildningen delar några anmärkningsvärda likheter. Som beskrivs i den första upptäckten av exosomer spårades en anti-TfR-antikropp genom elektronmikroskopi i retikulocyter (TH bacteria, 2011) från ytan av cellerna, till clathrinbelagda gropar, inuti tidiga endosomer, på ytan av inre vesiklar av multivesikulära endosomer och slutligen på de frisatta exosomerna efter fusion av de multivesikulära endosomerna med plasmamembranet (Fig. 4). RMT verkar utvecklas på ett liknande sätt och Bec-extracellulära mikrovesiklar har visat sig innehålla flera receptorer som är kända för att bära makromolekyler över BBB via RMT, inklusive TfR, LRPs, LDLR och IR (Haqqani, Delaney, et al., 2013).
från de beskrivna studierna bör det vara uppenbart att BBB-bärararmen för CNS-inriktning bsAb kräver noggrann optimering för varje RMT-receptor. Viktiga överväganden i utformningen av CNS-targeting bsAbs diskuteras nedan med tanke på” lärdomar ” från TFR-BACE1 bsAb utveckling och från vårt eget arbete med FC5 som en BBB-bärare antikropp.