9 Proteins roll i den Spliceosomala katalytiska kärnan
att jämföra storleken på snRNAs med de mycket större grupp II-intronerna ökar möjligheten att flera grupp II-intron-domäner kan ha ersatts av proteiner i spliceosomerna under evolutionen, vilket ger upphov till det moderna ribonukleoproteinet (RNP) eukaryota skarvningsmaskiner. Även om ingen en-till-en-korrespondens ännu existerar, är det lätt möjligt att identifiera spliceosomala proteiner som utför en funktion medierad av RNA-element i Grupp II-introner. Till exempel fungerar ett nummer av U2-tillhörande proteiner i att initiera och stabilisera U2 snRNA–förgrena sig platsinteraktionen (Fig. 6.3).5,85 i Grupp II-introner är U2-ekvivalenten (del av domän VI) kovalent kopplad till grenplatsen via en hyperstabil hårnålslinga i ett arrangemang som säkerställer bildandet och stabiliteten i deras interaktion (Fig. 6.2). Ur detta evolutionärt perspektiv är det inte förvånande att en stor del av spliceosomala proteiner direkt associerar med ett snRNA, vilket ofta hjälper det i sin funktion.5,85 många spliceosomala proteiner är emellertid involverade i att utföra regulatoriska funktioner som inte krävs i samband med en självsplitsande intron och kommer sannolikt att vara nyare tillägg till det spliceosomala proteinkomplementet.
Som nämnts ovan tros det att den sista gemensamma förfadern till eukaryoter hade en högt utvecklad, fullt funktionell spliceosome som liknade de som finns i moderna eukaryoter.1,2 även om denna spliceosome sannolikt innehöll betydligt färre komponenter jämfört med även de minsta av moderna spliceosomer, indikerar data att de flesta nyckelkomponenterna var närvarande i de tidigaste versionerna av spliceosomerna.1-4 faktum är att en delmängd av det spliceosomala proteomet som innehåller proteiner associerade med den katalytiska kärnan visar en signifikant nivå av bevarande bland olika eukaryota arter, med ett antal spliceosomala proteiner som är bland de mest konserverade cellulära proteinerna.85,86
som nämnts ovan är många väl karakteriserade ribozymer associerade med proteiner in vivo som förbättrar deras katalytiska aktivitet genom flera kända mekanismer.83 dessa inkluderar stabilisering av RNA: s funktionella struktur, hjälp vid bindning och positionering av substraten och hjälp vid bindning av funktionellt viktiga metalljoner. Emellertid har direkt deltagande i katalys hittills inte observerats för något av de studerade ribozymassocierade proteinerna.83,87 om man antar att spliceosomen är ett RNA-enzym, är de spliceosomala snRNA ovanliga ribozymer i många avseenden. Kanske viktigast är att de är ovanligt små för ett ribozym som katalyserar fosfodiesterbindningsklyvning via aktivering av en icke-angränsande nukleofil. Andra naturliga ribozymer som katalyserar sådana reaktioner, nämligen grupp i-och II-introner och RNAs P, är minst dubbelt längre än den kombinerade längden av humana U6-och U2-snRNA. Dessa ribozymer är också mycket större än de nukleolytiska ribozymerna som aktiverar en intilliggande 2′-hydroxylnukleofil för klyvning av fosfodiesterbindning.24,88,89 den större storleken tros tillåta dessa ribozymer att vikas in i komplexa strukturer stabiliserade av flera tertiära interaktioner, vilket i sin tur gör det möjligt för dem att skapa sofistikerade aktiva platser som kan exakt placera klyvningsstället, de aktiva platsmetalljonerna och fjärrnukleofilen för nukleofil in-line attack. Det är tänkbart att U6 och U2 snRNA, på grund av sin korta längd, i bästa fall bildar ett ineffektivt skarvningsribozym som kräver andra spliceosomala faktorer för stabil positionering av de aktiva platselementen och de reagerande grupperna.
Prp8, som är det mest konserverade spliceosomala proteinet, tros spela en sådan roll i den spliceosomala aktiva platsen. Prp8 är utan tvekan den mest intressanta av de spliceosomala proteinerna, eftersom det är ovanligt konserverat med 61% identitet mellan jäst och människa.86 det har emellertid få tydligt urskiljbara funktionella motiv i sin ~ 2300 aminosyralängd, och de funktionella domänerna som hittills har urskiljts är degenererade och utför sannolikt funktioner som inte är relaterade till den ursprungliga grundmotivets cellulära Roll.86 å andra sidan spelar Prp8 tydligt en mycket kritisk roll i det spliceosomala aktiva stället. Det har tvärbindats till 5′ och 3 ’ skarvplatserna och grenplatsen för premessenger rna, förutom U5 och U6 snRNAs, vilket indikerar att det är närvarande i den spliceosomala katalytiska kärnan och direkt kontaktar de kritiska spelarna i skarvningsreaktionen.86,90 Vidare har det visats att Prp8 interagerar med flera viktiga spliceosomala proteiner inklusive Snu114 och Brr2 (se nedan).86,91,92
mutationer i Prp8 är associerade med ett brett spektrum av spliceosomala defekter inklusive förändringar i spliceosomers förmåga att avvisa suboptimala skarvningsställen och undertryckande av defekter orsakade av mutationer i andra spliceosomala faktorer såsom Prp28, Brr2, U4 och U6 snRNA.86,93,94 en delmängd av Prp8-mutanter modulerar selektivt effektiviteten hos antingen det första eller det andra skarvningssteget, särskilt i suboptimala substrat.58,86,95-97 dessa observationer förklaras bäst av en hypotes om att Prp8 är involverad i stabilisering av alternativa, ömsesidigt exklusiva aktiva platskonformationer som antingen är redo för katalys av det första eller det andra steget av skarvning, och att vissa Prp8-mutanter kan leda till selektiv hyperstabilisering av ett av dessa tillstånd.58,96,98 medan betydande bevis tyder på att Prp8 sannolikt är involverad i positionering av substraten och stabilisering av det aktiva stället, finns det för närvarande inga direkta bevis som antyder eller motbevisar dess ytterligare engagemang i metalljonkoordinering eller direkt deltagande i spliceosomal katalys.
denna osäkerhet härrör från det faktum att mycket lite är känt om hur Prp8 utför sin funktion. En innovativ transposonmedierad screeninganalys indikerade att stora regioner av Prp8 är mycket känsliga för införande av transposoner och sannolikt fungerar som en enda strukturell enhet, även om det var möjligt att infoga transposoner eller till och med dela Prp8 i två fragment vid ett antal andra positioner utan förlust av lönsamhet.90,92 bortsett från en degenererad nukleär lokaliseringssignal nära dess N-terminal och ett degenererat RRM-motiv (RNA-igenkänningsmotiv) i mitten av proteinet har endast två andra funktionella domäner identifierats i detta ~ 2300 aminosyralånga protein.86
en degenererad variant av MPN / Jab1-domänen som är associerad med deubiquitinerande enzymer finns nära C-änden av Prp8.86-analys av högupplösningsstrukturen hos ett fragment av Prp8 innehållande denna domän har visat att metalljonbindningsstället för isopeptidas-centret är nedsatt, och därför fungerar det sannolikt inte som ett deubiquitinerande enzym.99 100 in vitro kunde ett fragment av Prp8 innehållande denna domän direkt binda till ubiquitin med en affinitet som var jämförbar med andra kända ubiquitinbindande proteiner.101 flera kända Prp8-mutationer som störde skarvning störde också in vitro ubiquitinbindning, vilket ökar möjligheten till en funktionell roll för ubiquitination vid skarvningsreglering. Viktigt är att proteomiska analyser har indikerat att flera spliceosomala faktorer, inklusive Sad1, Snu114, Rse1 och Prp8 i sig, är ubiquitinerade in vivo, och dessutom uppvisar det spliceosomala kärnproteinet Prp19 E3 ubiquitinligasaktivitet in vitro.101-105 vidare spelar ubiquitin en roll i bildandet och underhållet av tri-snRNP, eventuellt genom att modulera Prp8-medierad reglering av funktionen av Brr2.102 alternativt är det också möjligt att MPN/Jab1–domänen fungerar som en protein-protein-interaktionsplattform. Ett antal mutationer i Prp8 som faller inom detta område resulterar i ärftlig blindhet retinitis pigmentosa,86 och dessa mutationer försvagade interaktionen mellan Prp8 och Brr2 och Snu114.99
den högupplösta strukturen för ett annat fragment av Prp8 har bestämts som omfattar en mycket konserverad region (69% aminosyraidentitet mellan jäst och människa) belägen nära dess C-terminala domän. Analys av strukturen avslöjade närvaron av ett ASIC-hårnålfinger som liknar de som finns i ribosomala proteiner och en degenererad RNAs H-liknande domän.106-108 medan den övergripande geometrin hos RNAs H-liknande motiv vid nivån av sekundär och tertiär struktur var väl bevarad, visade den primära sekvensen en mycket lägre bevarandenivå och endast en av de tre katalytiska resterna är närvarande vid det aktiva stället. Den konserverade återstoden, ett aspartat, är involverat i koordinering av två katalytiska metalljoner i det aktiva stället för kanoniska RNAs h-domäner. I en studie resulterade mutation av denna rest i Prp8 i jäst i ingen detekterbar tillväxtdefekt, vilket kan indikera redundans eller brist på kritisk funktion.108 i en annan studie kunde dess effekt inte undersökas eftersom mutationen inducerade felveckning av proteinfragmentet.107 ingen metalljonbindning observerades av regionen motsvarande det aktiva stället för RNAs h-domänen när kristallerna odlades i så mycket som 200 mM MgCl2, vilket indikerar att det degenererade aktiva stället saknar metalljonbindningsförmåga. Vidare visade fragmentet av Prp8 innehållande denna domän en mycket svag RNA-bindningsförmåga, med en Kd på 20 kg till över 200 kg beroende på de testade RNA-arterna.106-108 även om fragmentet visade en mycket låg affinitet för bindande rna, visade det en preferens för bindning av duplex RNA innehållande fyrvägskorsningar.108 i aktiverade humana spliceosomer förutspås U2 och U6 snRNA att bilda en sådan struktur.53,69 det som gjorde denna RNAs H-liknande domän särskilt intressant var att aminosyrorna motsvarande dess aktiva plats är placerade intill rester i Prp8 som tidigare visades tvärbinda till 5′ – skarvplatsen i prekatalytiska spliceosomer.109 emellertid reducerades effektiviteten av bildningen av denna tvärbindning när de prekatalytiska spliceosomerna utvecklades till att bli katalytiskt aktiva spliceosomala komplex.109 den observerade minskningen i tvärbindningseffektivitet kan tolkas för att indikera att denna interaktion störs i aktiverade spliceosomer. Alternativt kan interaktionen kvarstå, men bildandet av tvärbindningen i sig avskaffas på grund av en mindre förändring i miljön hos de tvärbundna resterna. Om denna degenererade RNAs H-liknande domän verkligen är placerad i närheten av 5′ – skarvplatsen i katalytiskt aktiva spliceosomer, är det möjligt att det kan delta i att stabilisera den aktiva konformationen av snRNAs, placera substraten i det aktiva stället och/eller koordinera katalytiska metalljoner. Medan domänen i sig inte kan binda RNA eller metalljoner, är det möjligt att det i närvaro av andra aktiva platselement kan utgöra en del av substratet eller metalljonbindande fickor. Trots dessa spännande möjligheter förblir Prp8: s roll i spliceosomal katalys osäker.