olika motiv ensembler specificera icke-redundanta DNA-bindande aktiviteter av AP-1 familjemedlemmar i makrofager

statistiska analyser

i Fig. 1C, skillnader i genuttryck testades med hjälp av det oberoende T-testet (frihetsgrad = 1, två-tailed) på två replikerade experiment (n = 2). Differentiellt uttryckta gener i Fig. 1B identifierades med EdgeR55 med standardparametrar och med hjälp av cut offs FDR < 0.05 och log2 fold förändring ~ ~ pos = headcomp 2. I Fig. 2C, skillnader mellan varje grupp (Veh, delad och KLA 1 h) undersöktes med hjälp av oberoende T-test (frihetsgrad = 1, två-tailed); antalet loci i varje grupp för varje monomer är följande ATF3 (Veh = 1447, delad = 7460, KLA = 6997), Jun (2390, 3751, 3401), JunD (1351, 5976, 6422). Betydelse för motiv i Fig. 4A beräknades med hjälp av sannolikhetsförhållandet test (frihetsgrad = 1) som jämför förutsägelserna från den fullständiga TBA-modellen och den störda TBA-modellen vid alla loci bundna i Veh-behandlade makrofager för Atf3 (n = 23,160), Jun (n = 15,548) och JunD (n = 19,653). Betydelse för motiv i kompletterande Fig. 4C beräknades med hjälp av sannolikhetsförhållandet test (frihetsgrad = 1) som jämför de förutsägelser som gjorts av den fullständiga TBA-modellen och den störda TBA-modellen vid alla loci bundna av JunD i GM12878 (n = 7451), H1-hESC (n = 12,931), HepG2 (n = 41,318), K562 (n = 47,477) och SK-N-SH (38,960). Betydelse för motiv i Fig. 5b, kompletterande Fig. 5B, och kompletterande Fig. 5C beräknades med hjälp av sannolikhetsförhållandet test (frihetsgrad = 1) som jämför de förutsägelser som gjorts av den fullständiga TBA-modellen och den störda TBA-modellen vid alla loci bundna i KLA-behandlade makrofager för Atf3 (n = 36,745), Jun (n = 17,481), JunD (n = 31,641), Fos (n = 24,365), Fosl2 (n = 10,619) och JunB (n = 13,376). Signifikansvärden för Fig. 6F och S6F beräknades med hjälp av F-testet; antalet loci analyserade för monomerer i vehikelbehandlade makrofager är ATF3 (n = 4163), Jun (n = 3004) och JunD (n = 4148); antalet loci analyserade för monomerer i KLA-behandlade makrofager är: Atf3 (n = 4577), Jun (n = 3232), JunD (n = 4366), Fos (n = 4477) och JunB (n = 3616).

generera anpassat genom för BALB / cJ

ett anpassat genom för BALB / cJ genom att ersätta invarianta positioner för mm10-genomet med alleler rapporterade av Mouse Genomes Project (version 3 VCF-fil)43. För C57BL/6J användes mm10-referensgenomet från UCSC-genombläddraren. För att möjliggöra jämförelser mellan BALB / cJ och C57BL/6J under analys skiftades koordinaterna för det anpassade genomet för BALB/cJ för att matcha positionerna för mm10-referensgenomet med MARGE34. Vi analyserade inte några läsningar som föll inom raderingar i BALB/cJ. Läser som överlappade med en insättning tilldelades den sista överlappande positionen i referensstammen.

analys av ChIP-seq-toppar

Sekvenseringsläsningar från ChIP-seq-experiment mappades till mm10-sammansättningen av musreferensgenomet (eller BALBc/J-anpassade genomet) med den senaste versionen av Bowtie2 med standardparametrar56. Mappade ChIP-seq läser för att identifiera förmodade TF-bindningsställen med HOMER57 findPeaks-kommandot (med parametrar-storlek 200-L 0-C 0-fdr 0.9), med hjälp av ingångschipsexperimentet som motsvarar behandlingstillståndet. För att minska antalet falska positiva toppar beräknade vi IDR vid varje topp (med version 2.0.3 i idr-programmet) med HOMER-toppresultatet beräknat för varje replikatexperiment som ingång till IDR och filtrerade sedan alla toppar som hade IDR 0.0558. De novo motiv beräknades med HOMER findMotifsGenome.pl kommando med standardparametrar. Anrikning av de novo-motiv beräknades med användning av findKnownMotifs.pl program i HOMER med standardparametrar.

kvantifiering av RNA-uttrycksläsningar genererade från RNA – Seq-experiment anpassades till mm10 – musreferensgenomet (eller BALBc/J-anpassade genomet) med hjälp av STAR aligner med standardparametrar59. För att kvantifiera uttrycksnivån för varje gen beräknade vi RPKM med de läsningar som fanns inom en exon. Un-normaliserade sekvenseringsläsningar användes för att identifiera differentiellt uttryckta gener med EdgeR55; vi betraktade gener med FDR < 0.05 och en förändring i uttryck mellan två experimentella förhållanden två gånger eller större differentiellt uttryckt. För att kvantifiera uttrycket av begynnande rna antecknade vi våra ChIP-seq-toppar med antalet GRO-seq-läsningar (normaliserade till 10 miljoner) som låg inom 500 bps från toppcentret med HOMER annotatePeaks.pl kommando.

TBA-modellutbildning

för varje AP – 1-monomer under varje behandlingstillstånd tränade vi en modell för att skilja bindningsställen för varje monomer från en uppsättning slumpmässigt utvalda genomiska loci. Uppsättningen slumpmässiga bakgrundslokaler som används för att träna varje modell valdes enligt följande kriterier: (1) GC-innehållsfördelningen för bakgrundslokalerna matchar GC-innehållet i bindningsställena för en given monomer, (2) innehåller inga tvetydiga eller oföränderliga positioner och (3) antalet bakgrundssekvenser matchar antalet bindningsställen k. För var och en av sekvenserna i den kombinerade uppsättningen av bindningsställen och bakgrundslokaler beräknade vi den högsta log-odds-poängen (även kallad motivpoäng) för var och en av de n-motiv som kommer att inkluderas i model60-Motivmatchningarna i båda riktningarna övervägdes. Log-odds poäng mindre än 0 sattes till 0. Per standard förbehandling förfaranden före träning en linjär modell, vi standardiserade log-odds poäng för varje motiv, skalning uppsättningen poäng för varje motiv så att medelvärdet är 0, och variansen är 1. Standardisering skalar poängen för alla motiv till samma intervall (längre motiv har en större maximal poäng) och hjälper också till att minska effekten av multi-collinearity på modellträningen. Och så, de funktioner som används för utbildning vår modell är en n av 2k matris av log-odds poäng standardiserade över varje rad. För att generera motsvarande uppsättning etiketter tilldelade vi varje bindningsplats en etikett på 1 och varje bakgrundsloki en etikett på 0. Med hjälp av denna funktionsmatris och etikettmatris tränade vi vikter för varje motiv med en L1-straffad logistisk regressionsmodell som implementerats av scikit-learn Python package61. Motivvikter som visas i vår analys är medelvärdena över fem korsvalideringsrundor, med 80% av data för träning och 20% för testning i varje omgång. Modeller utbildades för ChIP-seqs genererade i denna studie samt data som hämtats från NCBI-genuttrycket Omnibus (anslutningsnummer GSE46494) och koda dataportalen (https://www.encodeproject.org).

kvantifiering av multipelkollinearitet

för att bedöma omfattningen av multikollinearitet i motif-poängfunktionerna som vi använde för att träna våra modeller tog vi varje funktionsmatris som motsvarar varje experiment och beräknade VIF för varje motif38. För att beräkna VIF bestämmer vi först bestämningskoefficienten, R2, för varje motiv genom att regressera log-odds-poängen för ett motiv mot log-odds-poängen för de återstående motiven. Därefter med hjälp av bestämningskoefficienten kan toleransen för varje motiv beräknas som skillnaden mellan 1 och bestämningskoefficienten (1 − R2). VIF är det ömsesidiga av toleransen \(\frac{1}{{1 – r^2}}\). Vi använde linear_model-modulen i sklearn Python-paketet för att beräkna bestämningskoefficienten.

Motivklustring och sammanslagning

Vi gjorde likheten hos alla par av DNA-sekvensmotiv genom att beräkna Pearson-korrelationen mellan de inriktade positionsannolikhetsmatriserna (PPMs) som motsvarar ett givet par motifs62. Pearson – korrelationen för ett par motiv A och B med längd i beräknas med formeln:

PPMs justerades först med hjälp av Smith–Waterman-justeringsalgoritmen 63. Kortare motiv är vadderade med bakgrundsfrekvensvärden före justering. Luckor i inriktningen var inte tillåtna och varje position i inriktningen gjordes med Pearson-korrelationen. Pearson-korrelationen beräknades sedan med användning av den optimala inriktningen. Därefter sammanfogades uppsättningar av motiv som har PPMs med en Pearson-korrelation på 0,9 eller högre genom att iterativt anpassa varje PPM inom uppsättningen och sedan medelvärdet av nukleotidfrekvenserna vid varje position.

bedömning av betydelsen av motiv för TBA

p-värden för TBA beräknades med hjälp av log-sannolikhetsförhållandet test. Varje motiv togs bort från uppsättningen funktioner som används för att träna en störd TBA-modell (med femfaldig korsvalidering). Vi använde sedan hela modellen (innehållande alla motiv) och den störda modellen för att beräkna sannolikheten för att observera bindning på alla bindningsställen och bakgrundssekvenser för en given monomer och alla bakgrundsregioner. Skillnaden i sannolikheten beräknad av hela modellen och den störda modellen användes sedan för att utföra chi-squared-testet för varje motiv. Chi-squared-testet utfördes med hjälp av scipy python package64.

jämförelse med andra metoder

BaMM motif och gkm-SVM kördes båda med standardparametrar. Vi använde den senaste versionen av den större skalan gkm-SVM, LS-GKM (sammanställd från källkod nedladdad från https://github.com/Dongwon-Lee/lsgkm på 8/25/16) och BaMM motif; v1.0 nedladdad från https://github.com/soedinglab/BaMMmotif39, 65. Båda modellerna utbildades med femfaldig korsvalidering. Modellprestanda gjordes med roc_auc_score-och precision_score-funktioner från metrics-modulen i sklearn.

förutsäga förändringar i AP – 1-bindning efter en timmes KLA-behandling

för att förutsäga förändringen i bindning efter KLA-behandling utnyttjade vi motivvikterna som lärt sig för var och en av n-motiven (wn) av en TBA-modell utbildad på Fordonsbehandlade data (Wveh = ) och en TBA-modell utbildad på 1-h KLA-behandlade data (Wkla = ) för varje AP-1-monomer. Den förutsagda bindningsförändringen för varje sekvens är då skillnaden mellan punktprodukten för de standardiserade motivpoängen beräknade för sekvensen var och en av k−bindningsställena (Sk = ) med KLA − motivvikterna och punktprodukten för motivpoängen och Veh-motivvikterna (Auskulkla-veh,k = Wkla-Sk-Wveh-Sk). Förutsägelser gjordes för alla genomiska loci som korsades med en topp för en av AP-1-monomererna i antingen vehikel-eller KLA-behandlingstillståndet.

förutsäga stamspecifik bindning med TBA

för att förutsäga stamspecifik bindning utnyttjade vi motivvikterna som lärt sig för var och en av n-motiven (wn) av en TBA-modell (W = ) för varje AP-1-monomer med hjälp av C57BL/6J-data och motivpoängen beräknade för var och en av k-bindningsställena med hjälp av den genomiska sekvensen för C57BL/6J och BALBc/J (SC57, k=, SBAL , k = ). Därefter beräknade vi skillnaden mellan motivpoängen för C57BL6/J och BALBc/J (Dn = ) och standardiserade sedan poängskillnaderna för varje motiv över alla k-bindningsställen som hade en mutation när man jämförde BALBc/J till C57BL/6J, vilket gav standardiserade motivpoängskillnader för varje bindningsplats (Zn = standardisera(Dn) = ). Slutligen gjorde vi sedan en förutsägelse för stamspecifik bindning genom att beräkna punktprodukten av motivvikterna och den standardiserade skillnaden mellan motivpoängen mellan C57BL6/EiJ och BALBc/J för kth: s muterade bindningsplats (GHz 57-BAL = W.

TBA-2strain model training

för varje genomisk loci som korsades med en topp för en av AP – 1-monomererna, i antingen C57BL/6J eller BALBc/J, beräknade vi den högsta log-odds-poängen för var och en av n-motiven som kommer att inkluderas i modellen, med hjälp av den genomiska sekvensen från båda stammarna,vilket ger två uppsättningar motivpoäng för var och en av k-bindningsställena (SC57 , k=, SBAL, k = ). Motivmatchningar i båda riktningarna övervägdes. Log-odds poäng mindre än 0 sattes till 0. Med hjälp av motif-poängen beräknar vi den standardiserade skillnaden mellan motif-poängen över de två stammarna som beskrivs i ovanstående avsnitt (Zn = ). Och så, de funktioner som används för utbildning vår modell är en n av k matris av log-odds poäng standardiserade över varje rad. Därefter beräknade vi log2-vikförhållandet för antalet ChIP-seq läser i C57BL/6J jämfört med BALBc / J för att representera omfattningen av stamspecifik bindning. Med hjälp av denna funktionsmatris och inställning av log2-vikförhållandet mellan bindning mellan de två stammarna som den beroende variabeln tränade vi vikter för varje motiv med linjär regression som implementerats av scikit-learn Python-paketet. Motivvikter som visas i vår analys är medelvärdena över fem korsvalideringsrundor, med 80% av data för träning och 20% för testning i varje omgång. Förutsägelser för stamspecifik bindning kan göras med hjälp av de beräknade vikterna enligt proceduren i föregående avsnitt.

ChIP protocol

Protein A och g Dynabeads 50/50 mix från Invitrogen stäms för ChIP (10001d, 10003d). IP mix består av 20 occl pärlor / 2 occlg antikropp per 2 miljoner Cellchip. Antikroppar mot AP-1-familjemedlemmar valdes för inriktning av icke-konserverade regioner för att minimera risken för icke-specifik bindning. Antikroppar listas i kompletterande tabell 3. För beredning tvättades pärlorna med 2 msk 0,5% BSA–PBS, sedan inkuberades pärlantikroppen med 0,5% BSA-PBS i minst 1 h på rotator (4 msk C). Tvätta 2 msk med 0.5% BSA-PBS, resuspenderas sedan i utspädningsbuffert (1% Triton, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl (pH 7, 4), 1 seki proteashämmare). Dubbel tvärbindning för ChIP: Media dekanterades från celler i 10 cm plattor, tvätta en gång kort med PBS (RT). Disuccinimidylglutarat (Pierce Cat # 20593) (utspädd i DMSO vid 200 mM)/PBS (RT) användes för 10 min. Sedan tillsattes formaldehyd till en slutlig koncentration av 1% under ytterligare 10 minuter. Reaktionen släcktes med 1: 10 1 M Tris pH 7.4 på is. Celler uppsamlades och tvättades två gånger med kalla PBS, spinning vid 1000 kcal g för 5 min. Kärnor isolering och ultraljudsbehandling: Resuspendera cell pellets i 1 mL kärnor isolering buffert (50 mM Tris–pH 8,0, 60 mM KCl, 0,5% NP40) + PI och inkubera på is för 10 min. Centrifugera 2000 CG i 3 min vid 4 C. C. Resuspendera kärnor i 200 oc färsk lysbuffert (0,5% SDS, 10 mm EDTA, 0,5 mm EGTA, 50 mM Tris-HCl (pH 8)) + PI. Ultraljudsbehandling: kärnor sedan sonicated (10 miljoner celler) för 25 min i en Biorupter (inställningar = 30 s = på, 30 s = av, Medium) med användning av tunna väggrör (Diagenode Cat# C30010010). Efter ultraljudsbehandling snurra max hastighet för 10 min vid 4 msk C. ChIP ställa upp: Sonicated DNA späddes 5 kg med 800 Utspädningsbuffert (1% Triton, 2 mm EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl (pH 7,4), 1 kg proteashämmare). En alikvot tas bort för inmatningsprover (5%). Prover på vid 4 C under rotation. Tvätt: ChIP tvättas 1 msk med TSE I (20 mM Tris–HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA), 2 msk med tse III (10 mM Tris–HCl pH 7,4, 250 mM LiCl, 1% IGEPAL, 1% deoxikolat, 1 mM EDTA), 1 msk med TE + 0,1% Triton X-100, överför till nytt rör och tvätta sedan en annan gång med te + 0,1% Triton X-100. Eluering: Elute med 200 occyl elueringsbuffert (1% SDS, 10 mM Tris pH 7.5) för 20 min vid RT, skaka på virveln eller en nutator eller rotator. De-tvärbindning: tillsätt 10 oc 5 M NaCl och inkubera på vid 65 oc C (eller minst 8 h). Rensa upp prover med Zymo ChIP DNA Clean och koncentrator. Elute i 100 UCL. Ta 40 ubisl och fortsätt till bibliotekets prep-protokoll.

PolyA RNA-isolering och fragmentering

RNA-isolering: RNA isolerades med användning av TRIZOL-reagens (Ambion cat# 15596018) och DIRECT-ZOL RNA mini-prep kit (cat# 11-330mb). Poly-a RNA-isolering: använd 0.2 Totalt RNA som utgångsmaterial för idealisk kartläggningseffektivitet och minimal klonalitet. Samla 10 oc oligo (dT) (neb cat# S1419S) pärlor per RNA-prov. Pärlor tvättades två gånger med 1 ci dtbb (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 M LiCl, 2 mM EDTA, 1% LDS, 0,1% Triton X-100). Pärlor var resuspended i 50 occoll av 2 occol DTBB. 50 oc pärlor blandades med 50 oc RNA och upphettades till 65 oc C för 2 min. RNA-pärlor inkuberades sedan i 10 minuter vid RT medan de roterades. RNA-pärlor uppsamlades sedan på en magnet och tvättades 1 msk vardera med RNA WB1 (10 mM Tris–HCl pH 7,5, 0,12 m LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% LDS, 0.1% Triton X-100) och WB3 (10 mM Tris–HCl pH 7,5, 0,5 m LiCl, 1 mM EDTA). Tillsätt 50 occyl Tris-HCl pH 7,5 och värm till 80 occyl C i 2 minuter för att eluera. Samla RNA och utföra en andra Oligo-dT pärla samling. Efter tvättning av den andra samlingen, i stället för eluering var 1 msk med 1 msk första strängen buffert; 250 mM Tris–HCl (pH 8,3), 375 mM KCl, 15 mM MgCL2 (ThermoFisher SSIII kit Cat# 18080093). Fragmentering: lägg sedan till 10 occyl av 2 occyls första strängbuffert plus 10 mM DTT och fragment DNA vid 94 occyls C för 9 min. Samla pärlor på magnet och överför eluat innehållande fragmenterad mRNA till en ny PCR-remsa. Bör återvinna 10 occl fragmenterat RNA. Första delen syntes: Vi blandade fragmenterad RNA med 0,5 µL slumpmässiga primer (3 µg/µL) Liv Tech #48190-011, med 0,5 µL oligo-dT (50 µM från SSIII kit), 1 µL dntp (10 mM Liv Tech, katt 18427088) och 0,5 µL SUPERase-I (ThermoFisher Katt#AM2696) och värme 50 °C i 1 min. Placera omedelbart på is. Vi lade sedan 5.8 ĩl ddH2O, 0.1 µL actinomycin (2 µg/µL Sigma katt#A1410), 1 µL DTT (100 mM Liv Tech katt# P2325), med 0,2 µL 1% Tween och 0,5 µL av Upphöjd III och inkubera 25 °C i 10 min, därefter 50 °C i 50 minuter. Pärla städa upp: Vi lade till 36 oc rnaclean XP (Ampure XP) och blandade, inkuberar för 15 min på is. Pärlorna uppsamlades sedan på en magnet och tvättades 2 msk med 75% etanol. Pärlor lufttorkades sedan för 10 min och elute med 10 oc-l nukleasfri H2O. andra strängsyntes. 10 µL av cDNA/RNA var blandat med 1,5 µL 10× Blå Buffert (Enzymatics katt# B0110L), 1 µL dUTP/dNTP mix (10 mM Affymetrix katt# 77330), 0.1 µL dUTP (100 mM Affymetrix katt# 77206), med 0,2 µL RNase H (5 U/µL Enzymatics katt# Y9220L), 1 µL DNA-polymeras I (10 U/µL Enzymatics katt#P7050L), 0.15 µL 1% Tween-20 och 1.05 occl nukleasfritt vatten. Reaktionen inkuberades vid 16 CCB i 2,5 h. rensning av pärlor: DNA renades genom tillsats av 1 CCB Seradyn 3 EDAC SpeedBeads (Thermo 6515-2105-050250) per reaktion i 28 CCB 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% slutlig koncentration) och inkubation vid RT i 10 min. Pärlorna uppsamlades sedan på en magnet och tvättades 2 msk med 80% etanol. Pärlorna lufttorkades i 10 minuter och eluerades i 40 occyl nukleasfritt vatten. DNA är redo för biblioteksprep.

Library prep protocol

dsDNA end repair: vi blandade 40 oc DNA från ChIP-eller RNA-protokoll med 2,9 oc H2o, 0.5 µL 1% Tween-20, 5 µL 10× T4 ligase buffert (Enzymatics katt# L6030-HC-L), 1 µL dNTP mix (10 mM Affymetrix 77119) och 0,3 µL T4 DNA-pol (Enzymatics P7080L) och 0,3 µL T4 PNK (Enzymatics Y9040L), 0.06 µL Klenow (Enzymatics P7060L) och inkubera i 30 minuter vid 20 °C. 1 µL av Seradyn 3 EDAC SpeedBeads (Thermo 6515-2105-050250) i 93 µL 20% PEG8000/2.5 M NaCl (13% slutlig) lades och inkuberas i 10 min. Bead clean-up: pärlor uppsamlades på en magnet och tvättades 2 msk med 80% etanol. Pärlorna lufttorkades i 10 minuter och eluerades sedan i 15 oc ddh2o. dA-Tailing. DNA blandades med 10.8 ĩl ddH2O och 0,3 µL 1% Tween-20, 3 µL Blå Buffert (Enzymatics katt# B0110L) på 0,6 µL dATP (10 mM Tech 10216-018) och 0,3 µL Klenow 3-5 Exo (Enzymatics P7010-LC-L) och inkuberas i 30 min vid 37 °C. 55.8 µL 20% PEG8000/2.5 M NaCl (13% slutlig) lades i en inkuberas i 10 min. Sedan pärla städa upp gjordes. Pärlor eluerades i 14 occyl. Y-form adapter ligering. Provet blandades med 0,5 occl av en BIOO streckkodsadapter( BIOO Scientific cat # 514104), 15 occl Rapid Ligation Buffer (Enzymatics cat@ L603-LC-L), 0,33 occl 1% Tween-20 och 0.5 oc T4 DNA-ligas HC (Enzymatics L6030-HC-L) och inkuberades för 15 min vid RT. 7 oc 20% PEG8000/2.5 M NaCl tillsattes och inkuberades för 10 min vid RT. pärla städa upp utfördes och pärlor eluerades i 21 oc. 10 oc-l användes sedan för PCR-amplifiering (14 cykler) med IgA-och IGB-primers (AATGATACGGCGACCACGA, CAAGCAGAAGACGGCATACGA).

GRO-seq

begynnande transkription fångades av global nuclear run-on sequencing (GRO-seq). Kärnor isolerades från TGEMs med användning av hypotonisk Lys (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 2 mM MgCl2, 3 mM CaCl2; 0.1% IGEPAL CA-630) och flash fryst i GRO-frysning buffert (50 mM Tris–HCl (pH 7,8), 5 mM MgCL2, 40% Glycerol). Springa. 3-5 106 106 bmdm-kärnor kördes på med BrUTP-märkta NTP med 3 nro–buffert (15 mm Tris-Cl (pH 8,0), 7,5 mM Mgcl2, 1,5 mM DTT, 450 mM KCl, 0,3 U/oc superase In, 1,5% Sarkosyl, 366 oc-m ATP, GTP (Roche), Br-UTP (Sigma 40 Aldrich) och 1,2 oc-m CTP (Roche, till begränsa körlängden till ~40 nukleotider)). Reaktionerna stoppades efter 5 min genom tillsats av 500 ukyl Trizol LS-reagens (Invitrogen), vortexed för 5 min och RNA extraherades och utfälldes enligt beskrivningen av tillverkaren. RNA-pellets resuspenderades i 18 oc ddH2O + 0,05% Tween (dH2O + T) och 2 oc fragmenteringsblandning (100 mMZnCL2, 10 mM Tris–HCl (pH 7,5)), inkuberades sedan vid 70 oc C i 15 min. Fragmenteringen stoppades genom tillsats av 2,5 occyl av 100 mM EDTA. BrdU anrikning. BrdU-anrikning utfördes med användning av BrdU-antikropp (IIB5) och AC-pärlor (Santa Cruz, sc-32323 AC, lot #A0215 och #C1716). Pärlor tvättades en gång med GRO bindningsbuffert (0,25 msk saltlösning-natrium-fosfat-EDTA-buffert (SSPE), 0,05% (vol/vol) Tween, 37,5 mM NaCl, 1 mM EDTA) + 300 mM NaCl följt av tre tvättar i GRO bindande buffert och resuspended som 25% (vol/vol) uppslamning med 0,1 U/mikhaill SUPERase-in. För att fragmentera RNA tillsattes 50 oc kall GRO-bindningsbuffert och 40 oc ekvilibrerade BrdU-antikroppspärlor och proverna roterades långsamt vid 4 oc C för 80 min. Pärlor spunnades därefter ner vid 1000 kcal g för 15 s, supernatant avlägsnades och pärlorna överfördes till en Millipore Ultrafree MC-kolonn (UFC30HVNB; Millipore)i 2 200 200 occyl GRO bindande buffert. IP-reaktionen tvättades två gånger med 400 occl GRO bindande buffert innan RNA eluerades genom inkubation i 200 occl Trizol LS (ThermoFisher) under mild omröring under 3 min. Elueringen upprepades en andra gång, 120 Aci l dH2O + T tillsattes för att öka supernatanten och extraherades enligt beskrivningen av tillverkaren. Slutreparation och decapping: för slutreparation och decapping löstes RNA-pellets i 8 oc–l TET (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.05% Tween 20) genom kraftig vortexing, upphettades till 70 oc C i 2 min och placerades på is. Efter en snabb dragning, 22 µL Repair av master mix (3 µL 10× PNK buffert, 15.5 µL dH2O + T, med 0,5 µL SUPERase-I RNase-Hämmare (10 U), 2 µL PNK (20U), 1 µL RppH (5U)) tillsattes, blandade och inkuberas vid 37 °C i 1 h. Att phosphorylate 5 slut, med 0,5 µL 100 mM ATP därefter till och reaktioner inkuberades i ytterligare 45 min vid 37 °C (hög koncentration av ATP släcker RppH aktivitet). Efter slutreparation tillsattes 2,5 50 mm EDTA, reaktionerna blandades och upphettades sedan till 70 C i 2 minuter innan de placerades på is. En andra BrdU-anrikning utfördes enligt beskrivningen ovan. RNA-pellets löstes i 2,75 occyl TET + 0,25 occol Illumina TruSeq 3 ’ Adapter (10 occolm), upphettades till 70 occol C för 2 min och placerades på is. 7 3’master mix (4.75 µL 50% PEG8000, 1 µL 10× T4 RNA ligase buffert, med 0,25 µL SUPERase-I, 1 µL T4 RNA Ligase 2 trunkerad (200U; NEB)) tillsattes, blandas väl och reaktioner inkuberas vid 20 °C under 1 h. Reaktioner efter utspädning genom tillsats av 10 µL TET + 2 µL 50 mM EDTA, upphettas till 70 °C i 2 min, placeras på isen och en tredje omgång av BrUTP berikning utfördes. RNA-pellets överfördes till PCR-remsor under 75% etanoltvätt och torkades. Proverna löstes i 4 occol TET (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 0,1 mm EDTA, 0,05% Tween 20) + 1 occoll 10 occolm omvänd transkription (RT) primer. För att annealera Rtprimeren inkuberades blandningen vid 75 CCB i 5 min, 37 CCB i 15 min och 25 CCB i 10 min. Att ligate 5’ Illumina TruSeq adapter, 10 µL 5’master mix (1.5 µL dH2O + 0.2% Tween 20, med 0,25 µL denaturated 5’TruSeq adapter (10 µM), och 1,5 µL 10× T4 RNA ligase buffert, med 0,25 µL SUPERase-I, med 0,2 µL 10 mM ATP, 5.8 µL 50% PEG8000, med 0,5 µL T4 RNA ligase 1 (5U; NEB)) tillsattes och reaktioner inkuberades i 25 °C i 1 h. Omvänd transkription utfördes med hjälp av Protoscript II (NEB) (4 µL 5× NEB FirstStrand buffert (NEB; E7421AA), med 0,25 µL SUPERase-I, 0.75 µL Protoscript II (150U; NEB)) vid 50 °C i 1 h. Efter tillsats av 30 µL PCR-master mix (25 µL 2× LongAmp Taq 2× Master Mix (NEB), med 0,2 µL 100 µM fram primer, 2.8 µL 5 M betain och 2 µL till 10 µM enskilda barcoding primer), blandningar som förstärktes (95 °C i 3 min, (95 °C i 60 s, 62 °C i 30 s, 72 °C i 15 s) x13, 72 °C under 3 min). PCR-reaktioner rensades med 1,5 volymer SpeedBeads (GE Healthcare) i 2,5 M NaCl/20% PEG8000. Bibliotek var Storlek vald på sidan / TBE geler till 160-225 baspar. Gelskivor strimlades genom att snurra genom ett 0,5 mL perforerat PCR-rör placerat ovanpå ett 1,5 mL rör. 150 occl Gel EB (0,1% LDS, 1 M LiCl, 10 mM Tris–HCl (pH 7,8)) tillsattes och slammet inkuberas under omröring över natten. För att rena det eluerade DNA: t tillsattes 700 zymogen ChIP-DNA-bindningsbuffert i 1,5 mL-röret innehållande den strimlade gelskivan och Gel EB, blandad genom pipettering och uppslamningen överförd till en zymominielute-kolonn. Proverna spunnits först vid 1000 kg i 3 minuter, sedan 10 000 kg i 30 sekunder. Flöde genom avlägsnades, och prover tvättades med 200 oc Zymo WashBuffer (med EtOH). Gelrester avlägsnades genom att snärta och kolonner tvättades genom tillsats av en annan 200 oc Zymo WashBuffer (med EtOH). Flödet genom avlägsnades, kolonner spunnits torra genom centrifugering vid 14,000 xnumx kg för 1 min och DNA eluerades genom tillsats av 20 xnumx xnumx förvärmd sekvensering TET (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mm EDTA, 0,05% Tween 20). Bibliotek ordnades.

Western blotting

celler lyserades med Igepal lysbuffert (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0.5% Igepal) och proteinkoncentrationer bestämdes med BioRad – proteinanalysreagens med användning av BSA som standard. Proteiner separerades på NuPage 4-12% bis-Tris gradientgeler (Invitrogen) och överfördes till ett nitrocellulosamembran (Amersham). Membran blockerades i TBS med 0,1% Tween – 20 och 5% BSA. Membran blottades med den indikerade primära över natten vid 4 msk C. Pepparrotperoxidaskonjugerade sekundära antikroppar detekterades med användning av ECL plus western blotting detection system (Amersham).

djur och cellodling

TGEMs samlades 3 dagar efter injektion från manliga 8-veckors C57BL/6J, eller BALB / CJ–Möss, och pläterade vid 20 kg 106 celler per 15 cm petriskål i DMEM plus 10% FBS och 1 kg penicillin-streptomycin. En dag efter plätering kompletterades cellerna med färska medier och behandlades med PBS (Veh) eller 100 ng/mL KLA i 1 timme och användes sedan direkt för nedströmsanalyser. iBMDM produceras genom infektion av BMDM med ett retrovirus innehållande myc och Braf V600E66. De odödliga cellerna odlas sedan ut under flera veckor. Alla djurförsök utfördes i enlighet med de etiska standarder som anges av University of California, San Diego Institutional Annual Care and Use Committee (Iucac).

lentivirus production

plommonguide modifierades för att innehålla en U6-bsmbi-spgRNA-ställning och en CMV-promotor som kör tagBFP2. 2 CRISPR-guider infördes för varje mål via PCR-förstärkning med H1-promotorn (bsmbi-plats/guide1/scaffold/H1-promotorn/guide 2/bsmb1-plats) för totalt 2 guider per virus (U6-och H1-driven) (kompletterande Tabell 4). Virus gjordes med pVSVg / ppAX2 systemet. Två dagar efter transfektion samlades media in och centrifugerades vid 4 kg C i 2 timmar vid 20 000 kg c. cellpellet rekonstituerades över natten vid 4 kg C i OPTI-MEM och lagrades vid -80 kg C.

produktion av CRISPR KO iBMDMs

KO iBMDMs producerades med användning av lentiviral infektion. iBMDM-CAS9-IRES-EGFP infekterades med MOI 100, mätt på 293t-celler, med Lentiblast (OZ biosciences) (5 occyl varje reagens) i OPTI-MEM. Detta centrifugerades sedan vid 1300g för 1 h vid rumstemperatur. Media avlägsnades sedan och celler kompletterades i benmärgsmedia (30% L-cell, 20% FBS, 1% penicillin/streptomycin i DMEM) i 2 dagar. Celler sorterades sedan för infektion genom uttryck av en transgen på virussekvensen (tagBFP2).

rapportsammanfattning

ytterligare information om experimentell design Finns i Nature Research Reporting Summary länkad till denna artikel.

kod tillgänglighet