Biotin och dess bindningspartner avidin används ofta idag i molekylärbiologi för en rad olika tekniker och protokoll. I det här inlägget kommer vi att diskutera den naturliga rollen av biotin, biotinylering, upptäckten av biotin-avidin-interaktionen och användningen av biotinylering i molekylärbiologi!
lär dig om in vivo biotinylering av bakteriella fusionsproteiner
Biotin är ett viktigt vitamin för livet
även om biotin är mest känt för sin roll i molekylärbiologi, är biotin (Vitamin H eller Vitamin B7) först ett viktigt koenzym som krävs av alla organismer för livet. Biotin syntetiseras endast av växter, de flesta bakterier och vissa svampar, så däggdjur måste få vitaminet genom externa källor. Människor absorberar det mesta av biotin de behöver i tunntarmen från mikrofloran som finns där.
Biotin är en kofaktor som i sin aktiva form är kovalent bunden till det aktiva stället för viktiga metaboliska enzymer inklusive biotinkarboxylas och dekarboxylaser. Dessa enzymer katalyserar överföringen av karboxylgrupper till organiska syror för att producera viktiga cellulära metaboliter. Biotin fungerar som en karboxylbärare från en förening till den andra. Dessa biotinberoende enzymer är väsentliga för processer som glukoneogenes, lipogenes, aminosyrametabolism och energitransduktion.
Biotinylering är den allmänna processen genom vilken biotin tillsätts till ett protein eller makromolekyl. Biotin kan tillsättas enzymatiskt eller kemiskt. Enzymatisk biotinylering förekommer naturligt i celler och är den process genom vilken biotin är kovalent bunden till en specifik lysin vid det aktiva stället för ett nyligen syntetiserat enzym. Biotinproteinligas (BPL) är ansvarig för denna mycket specifika post-translationella proteinmodifiering. De flesta organismer har mindre än fem enzymer i hela proteomet som biotinyleras. I E. coli till exempel är BPL, BirA, ansvarig för att biotinylera endast en lysin i hela organismen på biotinkarboxylbärarproteinet (BCCP).
upptäckten av biotin-avidin-interaktionen
i slutet av 1930-talet observerades att djur som matade en diet av främst äggvita skulle utveckla hudskador och andra fruktansvärda hälsoproblem. Denna sjukdom kallades ”äggvitskada” och bestämdes att bero på en brist på vitamin H som senare döptes om till Vitamin B7/biotin. Äggvitskador skulle plåga dessa djur även om deras diet kompletterades med biotin. Således var något i äggviten sekvestrerande biotin från att absorberas. 1940 Esmond E. Snell kunde rena proteinet som är ansvarigt för bindning av biotin, avidin. Avidin var träffande namn för kyckling,” Avian”, ägg det renades från. Snell bekräftade senare att avidin verkligen var den skyldige i äggvitskador genom att mata råttor renat avidin (Kresege et al., 2004). Avidin är ett glykoprotein som består av fyra identiska subenheter som var och en kan binda en molekyl biotin.
Biotin och avidin har en extremt stark affinitet för varandra. Egentligen är bindningen mellan dem en av de starkaste icke-kovalenta protein-ligandinteraktionerna som finns i naturen. När bindningen bildas påverkas den inte av förändringar i pH, temperatur eller organiska lösningsmedel.
användning av biotin i molekylärbiologi
Biotin är en relativt liten, vattenlöslig molekyl som inte stör de makromolekyler som den tillsätts till. Biotin har också en exponerad sidokedja som lätt kan manipuleras för att göra reaktiva arter utan att påverka avidinbindningsstället. Med alla dessa funktioner är det inte förvånande att forskare började utnyttja biotin och dess starka interaktion med avidin för molekylärbiologi och bioteknik.
När en polypeptid är biotinylerad (mer om detta nedan) kan den inkuberas eller samuttryckas med avidin eller ett strukturellt liknande protein som upptäcktes på 1960-talet, strepavidin. Biotin-avidin-komplexet kan sedan användas och / eller manipuleras för en forskares avsedda syfte. Två av de vanligaste användningarna av biotinylering i labbet är proteinrening och immunutfällningsexperiment. Biotinylerade proteiner eller komplex kan enkelt renas med kolonner eller pärlor som är belagda med avidin.
biotin-avidin-interaktionen har också anpassats för användning i immunhistokemi och antikroppsmärkning. I dessa experiment läggs biotin till en primär eller sekundär antikropp som riktar sig mot ditt protein av intresse respektive primär antikropp. Avidin bunden till en reporter läggs sedan till reaktionen för enkel upptäckt. De multipla biotinbindningsställena som finns på avidin är också idealiska för signalförstärkning under dessa experiment. Under detektion kan ett biotinylerat reporterenzym som förinkuberas med gratis avidin läggas till i ditt prov. Alla fria biotinbindande platser på detta komplex kan binda till din biotinylerade antikropp. Detta skapar ett stort nätverk av biotin-avidin-komplex bundna till ditt protein av intresse som leder till förstärkning av reportersignalen och enklare upptäckt. Denna strategi kallas Avidin-Biotin Complex (ABC) immunohistokemi (IHC). För mer information om ABC och IHC kolla Thermo Fisher Scientifics guide.
det finns en rad andra molekylärbiologiska tillämpningar för biotin och avidin. En kort lista över några andra vanliga applikationer och länkar till relevanta papper och webbsidor listas nedan.
- EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays)
- ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
- Southern/Northern Blotting
- Cell surface labelling
- Attaching polypeptides to a substrate
- Flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS)
- In situ hybridization
Methods for biotinylating your macromolecule of interest
To utilize the natural binding of biotin och avidin, makromolekyler av intresse måste först biotinyleras. Forskare har utvecklat flera metoder för att kemiskt biotinyla makromolekyler av intresse både in vitro och in vivo.
biotinyleringsreagens:
Biotins exponerade sidokedja kan tvärbindas till aminosyrafunktionella grupper in vivo via specialiserade kemikalier (biotinyleringsreagens). Det finns en mängd biotinyleringsreagenser tillgängliga som skiljer sig åt i de funktionella grupperna eller rester de riktar sig mot, liksom deras löslighet, och därmed är olika reagenser användbara för biotinylering i olika mikromiljöer. Det finns också reversibla och klyvbara biotinyleringsreagenser för att hjälpa till med den specifika elueringen av biotinylerade proteiner. För hjälp med att bestämma vilket biotinyleringsreagens som ska användas, kolla in Thermo Fisher Scientifics Biotinyleringsreagensvalverktyg.
AviTag och BirA:
proteiner kan också biotinyleras genom att utnyttja specificiteten hos E.coli BPL, BirA. Om du kommer ihåg, Bira biotinylater bara en lysin i hela E. coli-proteomen. Med hjälp av denna kunskap identifierade forskare den 13 aminosyrasekvens som krävs för BirA-erkännande och biotinylering. Denna 13 aminosyrasekvens kallas AviTag. Med hjälp av AviTag kan man märka ett protein av intresse med biotin genom att helt enkelt skapa en fusion där AviTag läggs till antingen N-eller C-änden av proteinet. BirA har visat sig effektivt biotinylat AviTag som uttrycker proteiner i bakterier, jäst, insekter och däggdjursceller. Kolla in Kay et al., 2009 för metoder på biotinylerande proteiner med BirA.
du hittar plasmider som innehåller både AviTag och BirA på Addgene!
Oligonukleotidmärkning:
Biotin kan tillsättas till endera änden av en DNA-sekvens under en polymeraskedjereaktion (PCR) med användning av en biotinylerad primer. Biotin kan också enzymatiskt införlivas under PCR med användning av ett biotin märkt dUTP. Det finns flera typer av biotin etiketter som kan läggas till en oligonukleotid beroende på din nedströms ansökan. Biotin märkta oligonukleotider kan användas i en mängd applikationer inklusive men inte begränsat till in situ hybridisering, blotting (norra och Södra) och affinitetsbindning.
Fotobiotinylering:
Fotobiotin kan användas för att icke-selektivt märka DNA och RNA. Fotobiotinacetat består av en biotinmolekyl bunden till en fotoreaktiv arylazidgrupp. Under starkt synligt ljus blir arylazidgruppen reaktiv och bildar en länk med närliggande nukleinsyror (McInnes et al., 1990). Fotobiotinylering är ibland enklare och billigare än andra enzymatiska metoder. Forskare har ofta använt denna metod för att fästa proteiner eller polypeptider till ett fast substrat (Holden och Cremer, 2003).
1. Chapman-Smith, A., & Cronan, je” molekylärbiologi av Biotin-bindning till proteiner; Symposium: näring, biokemi och molekylärbiologi av Biotin ” J. Nutr, 129 (2009a): 477-484. PubMed PMID: 10064313.
2. Chapman-Smith, A., & Cronan, je ” den enzymatiska biotinyleringen av proteiner: en post-translationell modifiering av exceptionell specificitet.”Trender inom biokemiska vetenskaper, 24.9 (1999b): 359–363. PubMed PMID: 10470036.
3. Sade, H. M. ” Biotin: det glömda vitaminet.”American Journal of Clinical Nutrition 75.2 (2002): 179-180. PubMed PMID: 11815306.
4. Nicole Kresge, R. D. S. och R. L. H. ” upptäckten av Avidin av Esmond E. Snell.”J Biol Chem 279.e5 (2004). PubMed PMID: 20353954.
5. Kay, B., Thai, S., & Volgina, V. ” Biotinylering av proteiner med hög genomströmning.”Metoder Mol Biol, 498 (2009): 185-196. PubMed PMID: 18988027. PubMed Central PMCID: PMC3223083.
6. McInnes, J. L., Forster, A. C., Skingle, D. C., & Symons, Rh ” beredning och användning av fotobiotin.”Metoder i enzymologi 184 (1990): 588-600. PubMed PMID: 2388593
7. Holden, M. A., & Cremer, PS ” Ljusaktiverat mönster av färgmärkta molekyler på ytor.”Journal of the American Chemical Society 125.27 (2003): 8074-8075. PubMed PMID: 12837056.
8. Pan, J. feng, Liu, N. hua, Shu, L. yuan, & Sun, H. ” tillämpning av avidin-biotin-teknik för att förbättra celladhesion på nanofibrous matriser.”Journal of Nanobiotechnology 13.1 (2015): 1–14. PubMed PMID: 25980573. PubMed Central PMCID: PMC4461904.
9. Huang, Q., Mao, Z., Li, S., Hu, J., & Zhu, Y. ” en icke-radioaktiv metod för liten RNA-detektion genom nordlig blotting.”Ris 7.1 (2014): 1-7. PubMed PMID: 26224555. PubMed centrala PMCID: PMC4884002.
10. Boer, E. De, Rodriguez, P., Bonte, E., Krijgsveld, J., Katsantoni, E., Heck, A., … Strouboulis, J. ”effektiv biotinylering och enstegsrening av taggade transkriptionsfaktorer i däggdjursceller och transgena möss.”PNAS 100.13 (2003): 7480-5. PubMed PMID:12802011. PubMed Central PMCID: PMC164612.
11. Liou, Y.-R., Wang, Y.-H., Lee, C.-Y., & Li, P.-C. ”Flytkraftsaktiverad cellsortering med riktade Biotinylerade Albuminmikrobubblor.”PLoS EN 10.5 (2015). PubMed PMID: 25993512. PubMed centrala PMCID: PMC4439073.
12. Ludwig, L. B., Hughes, B. J., & Schwartz, sa ” Biotinylerade sonder i den elektroforetiska mobilitetsskiftanalysen för att undersöka specifika dsDNA–, ssDNA-eller RNA-proteininteraktioner.”Nukleinsyror Forskning, 23.18 (1995): 3792-3793. PubMed PMID: 7479014. PubMed Central PMCID: PMC307283.
13. Howarth, M., & Ting, ai ” Avbildningsproteiner i levande däggdjursceller med biotin ligas och monovalent streptavidin.”Naturprotokoll 3.3 (2008): 534-545. PubMed PMID: 18323822. PubMed Central PMCID: PMC2671200.
14. Bloch, B. ” Biotinylerade sonder för in situ hybridisering histokemi: användning för mRNA-detektion.”Journal of Histochemistry and Cytochemistry: officiella tidningen för Histochemistry Society, 41.12 (1993): 1751-1754.PubMed PMID: 8245422.
ytterligare resurser på addgene-bloggen
- in vivo biotinylering av bakteriella fusionsproteiner
- lär dig hur biotin används i Split-BioID: en förbättrad metod för att studera protein-protein-interaktioner
- lär dig hur biotin kan användas med CRISPR