polymerer härledda från naturliga källor eller monomerer
aminosyror och sackaridbaserade material har undersökts i stor utsträckning för nukleinsyraleverans, som mer noggrant granskas någon annanstans . Dessa naturliga byggstenar har potential att ha minskad cytotoxicitet och, om de är optimerade, överlägsen övergripande funktion i förhållande till helt syntetiska biomaterial. Här kommer peptidbaserade och kolhydratbaserade nukleinsyraleveranspolymerer att undersökas (Fig. 29.7 B).
den första aminosyrabaserade polymeren som användes var poly (Lys), och många iterationer av denna katjoniska polymer har studerats omfattande på ett sätt som liknar PEI och de andra syntetiska polykationerna som beskrivits ovan. Poly (Lys) kan effektivt komplexa nukleinsyror, men dess transfektionseffektivitet är låg och det kräver cellbehandling med endosomolytiska medel såsom klorokin för att förbättra genuttryck. Ändå gav de tidiga studierna på poly(Lys) viktiga mekanistiska insikter relaterade till polyplex-formulering, intracellulär handel och endosomflykt . Medan det kliniska löftet om poly (Lys) är begränsat, har dessa tidiga studier haft en betydande inverkan på fältet.
Poly(histidin) (poly (His)) är en annan aminosyrabaserad polymer som har visat viss användbarhet för genterapi. Aminosyran His har en imidazol R-grupp innehållande en sekundär amin som ger poly(His) protonsvampaktivitet för endosomal flykt . Polymerer innehållande både Lys och His har också använts framgångsrikt i kombinationer. I dessa hybridpolymerer är de primära aminerna på Lys fullständigt protonerade och katjoniska vid fysiologiskt pH, vilket möjliggör effektiv elektrostatisk komplexbildning med DNA. Den lägre pKb av de sekundära aminerna från hans ger komplementär protonsvampaktivitet för endosomflykt . Transfektionseffektiviteten hos polymerer med poly(His) ympad till poly(Lys) förbättras signifikant genom tillsats av det endosomala störningsmedlet klorokin, vilket indikerar att polymererna ensamma fortfarande är delvis benägna att endosomala infångningar . Mycket grenade arkitekturer av His / Lys-polymerer och His – innehållande reducerbara polykationer har också visat sig effektivt leverera siRNA . Det finns också ett prejudikat för införlivande av aminosyrabaserade underenheter i andra genterapisystem för att producera ”hybrider” med förbättrad leveransfunktionalitet. Till exempel har His också använts för att modifiera chitosan (diskuteras mer Nästa) för att förbättra dess endosomala flykt-och transfektionseffektivitet .
Cell-penetrerande peptider (CPPs) och pH-responsiva, fusogena peptider är två andra klasser av peptider som har undersökts noggrant för att utlösa cellupptag respektive endosomal flykt. Dessa peptidklasser har använts både i kombination och som komponenter i multifunktionella polymer-och liposomala leveranssystem. De flesta CPP-och fusogena peptider härrör från bakterietoxiner och virusvektorer, eller de är syntetiska analoger av de naturligt förekommande peptiderna. Den transaktiverande transkriptionsfaktorn för HIV-1 och antennapedia-peptiden härledd från Drosophila är två exempel på väl studerade CPPs. Dessa peptider är vanligtvis rika på katjoniska aminosyror, och som ett resultat har syntetiska, argininrika CPPs av olika typer också visat sig förmedla biomakromolekylärt upptag av lastceller. Fusion av en CPP med en dsRNA-bindande domän har använts för att leverera siRNA i primära celler som anses svåra att transfektera . Andra CPP härledda från Transportan 10 (betecknad PepFect) och CADY har utformats för effektiv intracellulär leverans. Fusioner av tumörpenetrerande och CPPs har genererats som har visat tystnad av en onkogen förbättrad överlevnad hos möss förmågan hos CPPs att utlösa cellinternalisering har utnyttjats för leverans av flera klasser av terapeutisk last inklusive plasmid-DNA och siRNA (se CPP-recensioner för ytterligare information).
Fusogena peptider är pH-responsiva peptider som kan smälta samman med eller bilda porer genom det endosomala membranet. Ett exempel är difteritoxinet, som har en subenhet som bildar transmembranporer i endosomer som möjliggör inträde av ett disulfidbundet toxinfragment i cytosolen . Ett annat exempel är hemagglutinin, ett influensaprotein som skapar pH-beroende endosomal membranfusion för att leverera det virala genetiska materialet i cytoplasman . Peptidgalan är en syntetisk, pH-beroende, fusogen peptid som har karakteriserats i stor utsträckning . GALA själv monterar och sätter in i lipid-dubbelskikt vid surt pH, bildar en Por som tillåter membrantransitering . Till exempel har GALA framgångsrikt tillämpats för att förbättra effektiviteten av cytosolisk leverans av nukleinsyralast förpackad i PAMAM och liposomer .
polysackaridkitosan, oligosackaridliknande cyklodextriner och en mängd andra sackaridinnehållande glykopolymerer representerar en annan polymerklass för nukleinsyraavgivning. Till exempel kan naturliga anjoniska sackaridbaserade polymerer tillverkas i termodynamiskt stabila, polyelektrolytkomplex (PEC) NPs genom spontan förening utlöst via blandning av polyelektrolyter av motsatt laddning, som rapporterats av Prokop et al. . Typiskt tillverkas PEC NPs genom att blanda polyanioniska kärnpolymerer, såsom alginat eller kondroitinsulfat med koronapolykationer såsom sperminhydroklorid eller poly(metylen-co-guanidin) hydroklorid. Detta multipolymeric nanoparticulate att närma sig har visats för att vara effektivt för genöverföring in vitro , bestämt i cellsystem som är normalt eldfasta till genöverföring, liksom bukspottkörtel-holmar och antigen-att presentera celler. Dessutom kan Pec-koronala ytor dekoreras med PEG-ligandkomplex för att öka cellinriktningen och minska icke-specifikt upptag.
Chitosan, en polysackarid som består av glukosamin och N-acetyl glukosamin enheter bundna via glykosidbindningar av 1(1) 4, är en av de mest grundligt studerade sackaridpolymererna. Chitosan drar nytta av att vara ett ”grönt” tillvägagångssätt, eftersom det är en förnybar resurs som härrör från kitin. Denna naturliga polymer är också biologiskt nedbrytbar och icke-toxisk. Alonso-laboratoriet introducerade kitosanbaserade NPs gjorda via jonotropisk gelering, baserat på interaktionen mellan de negativa grupperna av pentasodiumtripolyfosfat och de positivt laddade aminogrupperna på kitosan. Kitosans kemi är också anpassningsbar till nonviral genterapi, eftersom den innehåller flera primära och sekundära aminer som kan endosomolys via protonsvampseffekten. Därför har chitosan undersökts som en pH-responsiv polymer för nukleinsyraavgivning. Howard et al. anställd chitosan NPS innehållande siRNA för att slå ner förbättrat grönt fluorescerande protein (eGFP) i både h1299 humana lungkarcinomceller och murina peritoneala makrofager (77,9% respektive 89,3% reduktion i egfp-fluorescens) . Chitosan NP har en hög potential för transmukosal leverans. Effektiv in vivo RNAi uppnåddes i bronkiolära epitelceller av transgena eGFP-möss efter nasal administrering av kitosan/siRNA-formuleringar (37% och 43% reduktion jämfört med missanpassning respektive obehandlad kontroll). De huvudsakliga nackdelarna med kitosan är dålig löslighet i fysiologiska buffertar och lägre endosomolytisk aktivitet jämfört med vissa starkare protonsvamppolymerer. Som ett resultat har flera varianter av kitosan gjorts med modifieringar för att öka endosomal flykt och löslighet. Till exempel har PEI och imidazoler båda konjugerats till kitosan för att förbättra dess prestanda i genterapier .
katjoniska polymerer som innehåller beta-cyklodextriner (Bisexuell-CD) visade tidigt löfte för klinisk RNAi. Katjoniska oc-CD-baserade polymerer (oc-CDP) syntetiseras genom kondensation av en diamino-cyklodextrin monomer med en diimidatkomonomer kan bilda polyplex med nukleinsyror, och deras transfektionsprestanda beror på OC-CDP-struktur . De pp-CD-innehållande polykationerna är särskilt unika eftersom cyklodextriner innehåller ett inre hålrum som kan användas för att bilda inklusionskomplex med hydrofoba delar. Till exempel binder till den hydrofoba molekylen adamantin, och detta ger ett bekvämt ”handtag” för att functionalize ytpolyplexerna som tillverkas av accdps med PEG eller targeting ligands . Davis-laboratoriet översatte detta koncept från bänkskiva till kliniska prövningar . Denna bärare var grunden för en rapport som demonstrerade det första exemplet på human RNAi med användning av riktade polymera NPs. Denna bärare var sammansatt av occuccdps functionalized med både PEG och cancer-targeting ligand transferrin . Efter detta landmärkesfynd avslutades den kliniska prövningen främst på grund av dosbegränsande toxiska händelser utan uppföljningsstudier. Arrowhead Pharmaceuticals fokuserade därefter på konjugat och inga uppföljningsfas III kliniska prövningar initierades.
en mängd andra nya, syntetiska katjoniska glykopolymerer finns också i utvecklingsledningen för kliniska tillämpningar av nukleinsyraleverans . Reineke lab har gjort viktiga bidrag på detta område (Se senaste recensionen Ref. ), och en exempelklass av glykopolykationer som utvecklats av denna grupp är poly(glykoamidoamin)s (PGAAs) . Ett bibliotek av PGAAs gjordes genom kondensationsreaktionen mellan kolhydrat-och oligoaminkomonomerer. Dessa PGAAs varierades baserat på en mängd olika parametrar, inklusive kolhydratstorleken, hydroxyltalet och stereokemi, aminantalet och huruvida heterocykliska grupper var närvarande eller inte. Dessa polymerer har screenats för genleverans och optimerade formuleringar har identifierats som underlättar effektiv DNA-förpackning och intracellulära leveransegenskaper. Reineke-gruppen har också sökt en mängd trehalosbaserade polymerer, och lovande resultat fortsätter att föreslå potentialen för klinisk translaterbarhet av denna säkra och effektiva klass av polymerer . Denna glykopolymer har också anpassats för att leverera CRISPR-baserad transkriptionsaktivator .
exosomer är cell-härledda extracellulära vesiklar innehåller en mängd olika nukleinsyratyper. Dessa naturfordon deltar i cellkommunikation och används alltmer i läkemedels-och genleverans . En stor utmaning i att använda exosomer för genleverans är lastning av fordonen med nukleinsyror. Medan elektroporation är den vanligaste metoden för lastning DNA, ultraljudsbehandling, extrudering, och frysa-tina cykler är andra metoder för lastning exosomer . Lastning av exogen siRNA eller DNA förblir en utmaning på grund av låg effektivitet och aggregering under elektroporation. För regenerativ medicin kan exosomer härledda från stam-eller stamceller uppmuntra vävnadsregenerering på egen hand utan exogent levererat DNA inklusive muskelregenerering , sårläkning , angiogenes och broskreparation .