diskussion
våra resultat visar att genom noggrann planering, utbildning och standardisering av reagenser och protokoll har ett transnationellt laboratorienätverk kapacitet att producera konsekventa och jämförbara HAI-analysresultat. De fem folkhälso-och akademiska laboratorierna som deltog i denna studie var en del av PCIRN, som utvecklades för att öka Kanadas nationella kapacitet att stödja vaccin och annan influensaforskning i händelse av en pandemi. I en pandemisituation, med högvolym, högtryck och geografiskt spridd influensatestning, kommer standardisering av hai-analysen att vara av största vikt för att säkerställa jämförbarhet av resultat mellan laboratorier. Pcirn-laboratorierna visade en hög standard för Reproducerbarhet inom laboratoriet, med 99,8% precision av dubbletter (99.2% till 100% per laboratorium), 97,8% av titrarna inom ett 2-faldigt intervall under upprepade analysdagar (93,3% till 100% per laboratorium) och 91,1% av testserumet som visar reproducerbarhet av titer över varje enskild upprepning av sexanalysprotokollet (60% till 100% per laboratorium). Interlaboratorisk Reproducerbarhet var också hög, med mediantitrar över alla replikat från de fyra icke-referenslaboratorierna inom 2-faldigt av referenslaboratoriet för 100% av de testade sera. På en per-laboratorium basis, titrar av 94,3% och 98.9% av proverna kvantifieras inom en enda utspädning av referenslaboratoriet respektive konsensustitrarna (intervall, 85% till 100% och 95% till 100%). Dessa procentsatser uppfyller typiska tröskelvärden för godtagbarhet för Hai-analysvariabilitet (dvs. minst 80% av proverna ligger inom 1 utspädning av nominella värden och/eller GMT för alla analyser ). Hai-analysspecificitet (100%) och känslighet (87,5% till 100%) över pcirn-laboratorier var på samma sätt väl inom acceptanskriterierna för tidigare studier (dvs., 100% av de negativa proverna bör kvantifieras enligt nedan kvantifieringsnivåer, och minst 80% av de positiva proverna bör kvantifieras som positiva ).
för den intralaboratoriska komponenten i Hai-analysvariabilitet förefaller repeterbarhet inom pcirn-laboratorier liknande den som visas i andra studier (5, 22). En varning av dessa tidigare studier var att inte mer än tre upprepningar undersöktes, trots vanliga immunanalysvalideringsmetoder för att undersöka sex eller flera upprepade analyser (24-27). Som sådan är det inte klart om deras data är direkt jämförbara med resultaten bestämda över sex analyser i denna studie. Icke desto mindre verkar vårt resultat av 0% till 6.7% (median, 0%) av analyser med resultat som skiljer sig mer än 2-faldigt från andra analysrepetitioner jämförbara med 4.8% till 7.1% som tidigare noterats i ett laboratorium (22) och 0% till 15% (median, 2%) i nio laboratorier (5).
våra resultat av hög Hai-titerreproducerbarhet mellan geografiskt spridda PCIRN-laboratorier står i kontrast till tidigare rapporter som visar väsentlig variation mellan internationella laboratorier som utför denna analys (5, 6, 9-12). Till exempel fann data från en stor samarbetsstudie (11 laboratorier) GCV per prov från 84% till 803% (median GCV per virus på 138%, 155% och 261% ). Andra studier rapporterade GCVs för H1N1-och H5N1-prover som sträckte sig över 95% till 345% (11) och 22% till 582% (6), och GMT skilde sig mellan laboratorier upp till 80 gånger (11) eller 128 gånger (9). Medan tidigare rapporter ofta inkluderade högre antal deltagande laboratorier än den aktuella studien, även när bara sex laboratorier bidrog med data, var median interlaboratory GCV 83% för fem H1N1-prover, varav 80% översteg en 4-faldig skillnad mellan laboratorier (11). Däremot visade den aktuella studien median GCVs per virus på endast 39% och 17%, med 95% av proverna inom en 4-faldig skillnad mellan laboratorier. Ett prov översteg 4-faldig skillnad; titern var inte kvantifierbar för detta prov vid ett laboratorium, och därmed tilldelades det lägsta värdet snarare än uppmätt. Om det provet utelämnades från analyser skulle den maximala GCV vara 75,5%, vilket skulle representera ett värde som är lägre än minsta GCV i andra studier. Även om det provet visade högre variation än andra, verkade detta låga mätområde i allmänhet mindre exakt än högre intervall. Till exempel varierade GCV från 43,4% till 156,4% vid titrar mellan 10 och 80 jämfört med 11,1% till 53,1% vid högre titrar (Fig. 3). Större variation med lägre titerprover har också beskrivits tidigare (23) och bidrog sannolikt till inkongruenta seroprotektionsklassificeringar i den aktuella studien för de tre H1N1-proverna med titrar närmast tröskeln på 40 (konsensustitrar på 22, 24 och 43). Trots detta förblev diagnostisk noggrannhet för seroprotektion över pcirn-laboratorier totalt sett hög (93,6% när konsensustitrar användes för att definiera seroprotektion och 89,5% jämfört med referenslaboratorievärden).
hög överensstämmelse mellan interlaboratoriska HAI-titrar i pcirn-laboratorier kan relatera till noggrann harmonisering av HAI-analysförfaranden och reagenser över PCIRN. Deltagare i tidigare studier som visade hög interlaboratorisk variabilitet använde vanligtvis HAI-analysmetoder som varierade mellan laboratorier. Analysvariabler som tros bidra till variabilitet i resultat inkluderade mängden tillsatt virus, virusodlingssystemet (t. ex. rde-behandling, den initiala serumutspädningen, typen och åldern för de använda RBC: erna och den tid som tillåts för RBC-sedimentering (5, 11, 12). Överraskande, dock, när Wood et al. under förutsättning att kommersiella och offentliga laboratoriedeltagare som deltar i säsongsinfluensavaccintestning i Europa med ett detaljerat standardförfarande att följa och vanliga reagens/material rapporterade de att interlaboratorisk variation inte förbättrades signifikant (10). Författarna spekulerade i att ihållande” lokala tekniska variationer”, liksom olika RBC-leverantörer, kan ha påverkat reproducerbarheten mellan laboratorier men noterade att ytterligare standardisering var bortom gränserna för genomförbarhet för deras studie. Senare publikationer tolkade dessa resultat som indikerar att Hai-analysstandardisering mellan laboratorier i allmänhet inte är ett genomförbart tillvägagångssätt för att harmonisera HAI-resultat över olika laboratorier (8, 12), och minst en grupp har försökt utveckla en modifierad och mer robust HAI-analys för att generera mer tillförlitliga och reproducerbara data (22).
i den aktuella studien följde pcirn-laboratorierna strikt standarden, allmänt tillgänglig Världshälsoorganisationen HAI-analysprotokoll, där punkter som var föremål för tekniska eller tolkningsvariationer harmoniserades mellan laboratorier innan studien påbörjades. Viktiga reagenser (t.ex. rde, RBC, viruslager) erhölls från samma leverantörer så mycket som möjligt. Dessutom tillät en begränsning av testningen till en enda tekniker vid varje testplats ökad standardisering. Den möjliga effekten av att använda flera personal vid varje laboratorium testades inte i denna studie. Även om användningen av flera operatörer potentiellt skulle kunna öka variabiliteten, visade den enda studien som undersökte denna möjlighet för Hai-testning ingen signifikant skillnad mellan resultaten från två operatörer i samma laboratorium (22).
potentiella variationer mellan laboratorier i de virusstammar som odlats för användning i analysen minimerades mellan pcirn-laboratorier genom att använda virala frölager från en enda källa som odlades i samma cellinje under liknande förhållanden vid alla laboratorier. Vi spekulerar i att interlaboratorisk Reproducerbarhet kan vara mottaglig för ännu ytterligare förbättringar var virala arbetsbestånd som skulle produceras centralt och distribueras till deltagande laboratorier. Betydelsen av virala stamvariationer för Hai-slutpunktstitrar illustreras väl av de 2-till-3-faldiga lägre titrarna som demonstrerades i en studie när HAI-analysen använde en A/Cal pH1N1-stam jämfört med X179A reassortant som fortfarande hade ekvivalenta hemagglutininer och neuraminidaser (11). Tyvärr sekvenserades inte lager som en del av denna studie, och så kan vi inte verifiera att alla laboratorier använde virus med identiska hemagglutininsekvenser. Även om mindre sekvensvariationer hade införts genom lokal förökning av virusbestånd var variationen mellan laboratorier i denna studie liten, och det är därför svårt att föreställa sig hur användningen av bestånd med identiska HA-sekvenser kan ytterligare minska variationen. Även om skillnaderna inte översteg 2-faldigt i denna lilla provuppsättning, mindre variationer i HA-sekvens introducerad genom lokal förökning av virala bestånd kan vara en möjlig förklaring till trenderna för underskattning av H1N1-titrar och överskattning av H3N2-titrar.
olika studier har rapporterat minskad interlaboratorisk variation i Hai-titrar genom att kalibrera resultat mot internationella standarder (6, 11-13); sådana standarder finns emellertid inte för nuvarande säsongsinfluensa B och influensa A H3N2-virusstammar, och den konstanta antigena driften av säsongsstammar som driver årlig omformulering av vaccinerna kan mycket väl kräva kontinuerlig utveckling och validering av nya standarder. I denna studie verkar den interlaboratoriska jämförbarheten överlägsen den som uppnås genom användning av även de mest effektiva kalibreringsstandarderna. Till exempel, efter kalibrering med IS 09/194, Wood et al. (11) rapporterade att maximala skillnader mellan GMT vid olika laboratorier minskade från 80-faldigt till 64-faldigt (dvs. ett värde som fortfarande är märkbart högre än den maximala 11-faldigt i den aktuella studien) och att GCV—intervallen mellan laboratorier minskade från 95% till 345% (median, 105%) till 34% till 231% (median, 109%) – dvs. långt över intervallet 0% till 156% (median, 27%) som ses i denna studie. På samma sätt minskade användningen av ersättning 10/202 GCV mellan laboratorier från ett intervall på 108% till 157% till ett intervall på 24% till 144% över fem prover och maximala skillnader mellan laboratorier från 43-faldigt till 21-faldigt (13), och med användning av 07/150-standarden, Stephenson et al. (6) minskade median GCV för 15 NIBRG-14 H5N1 clade 1-prover från 125% (intervall, 31% till 582%) till 61% (34% till 535%).
medan den exakta orsaken till den höga överenskommelsen mellan pcirn-laboratorierna jämfört med tidigare studier inte kan fastställas, underlättades vår framgång av det incitament som vi hade som ett nationellt nätverk för att arbeta mot det gemensamma målet att etablera reproducerbara processer. Detaljerad och rigorös process-och reagensharmonisering mellan platser är kanske den enda ”nya” aspekten vi tog med till denna studie, jämfört med den långvariga litteraturkroppen som visar dålig Hai-Reproducerbarhet mellan laboratorier. Våra data tyder dock på att med noggrann standardisering kan interlaboratoriska variationer i HAI-titrar reduceras till nivåer som liknar de som observerats i enskilda laboratorier. Potentiella nästa steg för att minimera variationer i Hai-titrar i laboratorier över hela världen skulle vara mobilisering av nätverk/konsortier, implementering av riktlinjer och/eller lagstadgade krav för användning av standardprocedurer och reagenser, standardiserad utbildning för att säkerställa reproducerbarhet och tillhandahållande av stöd och/eller incitament för laboratorierna att omfamna ”standardisering” – konceptet.