Sulfatreducerande bakterier i mänskliga avföring och deras samband med inflammatoriska tarmsjukdomar

Abstrakt

Vi har sökt efter sulfatreducerande bakterier i avföring från 41 friska individer och 110 patienter från en Hepato-Gastro-Enterologienhet med hjälp av ett specifikt flytande medium (Test-kit Lab Uscubbie, Compagnie Fran Uscubaise de g Uscubaothermie, ORL Uscuba, Frankrike). De 110 patienterna separerades hos 22 patienter med inflammatoriska tarmsjukdomar och 88 patienter på sjukhus för andra lägre (n=30) eller övre (n=58) matsmältningssjukdomar. Sulfatreducerande bakterier isolerades från 10 friska individer (24%), 15 patienter med inflammatoriska tarmsjukdomar (68%) och 33 patienter med andra symtom (37%). En multiplex PCR utformades för identifiering av Desulfovibrio piger (tidigare Desulfomonas pigra), desulfovibrio fairfieldensis och Desulfovibrio desulfuricans och applicerades på ovanstående isolat. Stammarna av sulfatreducerande bakterier bestod av D. piger (39 isolat), D. fairfieldensis (19 isolat) och D. desulfuricans (ett isolat). Förekomsten av D. piger var signifikant högre hos patienter med inflammatorisk tarmsjukdom (55%) jämfört med friska individer (12%) eller patienter med andra symtom (25%) (P<0,05).

1 Introduktion

Crohns sjukdom (CD) och ulcerös kolit (UC) är kroniska inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD) av okänd etiologi, men de kommer sannolikt att förlita sig på miljö -, genetiska och immunfaktorer . Ett infektiöst ursprung har föreslagits, och många mikroorganismer har varit inblandade i avsaknad av övertygande argument. I båda syndromen svarar emellertid tarminflammationen på antibiotikabehandling. I djurmodeller av kronisk kolit är luminal flora en viktig kofaktor för att sjukdomen ska uppstå . Detta kan förklara det förnyade intresset för tarmflorans roll som orsak till dessa störningar .

Sulfatreducerande bakterier (SRB) är anaeroba mikroorganismer som utför dissimilatorisk sulfatreduktion för att erhålla energi, vilket resulterar i frisättning av en stor mängd sulfid. De är vanligtvis isolerade från miljökällor, men finns också i matsmältningskanalen hos djur och människor. Som Desulfomonas pigra har omklassificerats som Desulfovibrio piger comb. nov. , mänskliga isolat av SRB består nästan uteslutande av desulfovibrio-arter . Nya resultat tyder på att SRB kan ha en roll i mänskliga sjukdomar. De har associerats med den kliniska svårighetsgraden av mänsklig periodontit och isolerats från djupa abscesser (buk eller hjärna), blod eller urin . I dessa inställningar har de flesta stammar identifierats som desulfovibrio fairfieldensis, en nyligen föreslagen ny art , av 16S ribosomal RNA-gen (16S rDNA) sekvensering. Desulfovibrio desulfuricans, typarten av släktet Desulfovibrio, har också isolerats från mänskliga exemplar . Implikationen av SRB i IBD har föreslagits eftersom deras metaboliska slutprodukt, vätesulfid, är en cytotoxisk förening . Denna förening kan verka genom en hämning av butyratoxidation, den huvudsakliga energikällan för kolocyter. Försämringen av funktionerna i tarmepitelet skulle leda till celldöd och kronisk inflammation. Arten av SRB associerad med IBD har emellertid ännu inte identifierats. Deras identifiering skulle tillåta att leta efter virulensfaktorer såväl som deras mottaglighet för antimikrobiella medel.

i medicinska laboratorier isoleras SRB sällan från humana prover på grund av en långsam tillväxt. Kolonier uppträder efter mer än 3 dagars inkubation och märks inte, övervuxna av den medföljande floran, såvida de inte är den dominerande eller enda arten närvarande. Således är deras sökning i avföring svår om inte ett specifikt medium används. Sådana medier innehåller vanligtvis en organisk förening (elektrondonator och kolkälla), sulfat (elektronacceptor), järn och ett reduktionsmedel. Tillväxten av SRB i specifika odlingsmedier detekteras lätt genom en svärtning av mediet på grund av vätesulfid (H2S) produktion vilket resulterar i bildandet av en järnsulfidfällning. En gång isolerad från kliniska prover kan identifiering på artnivå vara svår. Det är till exempel inte möjligt att differentiera D. fairfieldensis och D. desulfuricans genom fenotypiska tester. Således är genförstärkning ett värdefullt verktyg för att uppnå en sådan identifiering.

huvudsyftet med denna studie var att bestämma vilken art av DESULFOVIBRIO som kan associeras med IBD om någon. För detta ändamål användes ett specifikt flytande medium (Test-kit Lab Exporge, Compagnie Fran Exceptionisede G. O. O. Thermie, Orl. O. O., Frankrike) för tillväxt av SRB från avföring från friska individer och patienter på sjukhus i Hepato-Gastro-Enterologienheten i Centre Hospitalier et Universitaire de Nancy, Frankrike. En multiplex PCR utformades för identifiering av isolaten på artnivå.

2 Material och metoder

2.1 patienter

avföring från 41 friska individer (17 män och 24 kvinnor; medelålder 38 år, intervall 1-101 år) och 110 patienter (67 män och 43 kvinnor; medelålder 57 år, intervall 14-100 år) från Hepato-Gastro-Enterologienheten vid Centre Hospitalier et Universitaire de Nancy, Frankrike, samlades in. Friska individer konsulteras i följd för en kontroll. Ingen patogen mikroorganism hittades i deras avföring. Friska individer och patienter har inte haft någon antibiotikabehandling i månaden innan provet erhölls. Patienterna delades in i tre grupper: IBD (n=22) inkluderade 17 CD och fem UC; andra lägre tarmsjukdomar (n=30) inkluderade 23 patienter med milda eller måttliga symtom som buksmärta, tarmtransiteringsproblem och rektorragi och sju patienter med koloncancer; övre matsmältningssjukdomar (N=58) inkluderade gallsten, cirros, hepatocellulärt karcinom, mag-och bukspottkörteltumörer. IBD diagnostiserades på kliniska, endoskopiska och histologiska fynd. De flesta av IBD-patienterna uppvisade en aktiv sjukdom (Tabell 1).

2.2 SRB detektion och uppräkning

ett gram avföring blandades med 4 ml fosfatbuffrad saltlösningsbuffert och centrifugerades (3000 rpm, 5 min). En milliliter supernatant inokulerades omedelbart i ett flytande medium (Test-kit Lab Accord, Compagnie Fran account, ORL account, Frankrike) enligt tillverkarens anvisningar. I korthet består test-kits Lab-testet av flaskor innehållande 9 ml av ett specifikt medium (organiska föreningar: laktat och acetat, reduktionsmedel: titancitrat) anaerobt konditionerat för SRB-detektion. Det ympas med en spruta genom en gummilock. Detta limpid och färglösa medium har ursprungligen utformats för detektering av SRB från miljöprover. Det jämfördes med det vanliga Postgates fasta medium E (organisk förening: laktat, reduktionsmedel: askorbinsyra och tioglykolsyra) , inokulerad parallellt under anaerob atmosfär. SRB räknades upp med långa och smala rör fyllda med det senare mediet och inokulerades med decimalutspädningar av avföringen. Alla inokulerade medier inkuberades vid 37 kcal C i 2 månader. Närvaron av SRB fastställdes genom bildandet av en svart fällning (järnsulfid) i flytande media och genom utseendet av svarta kolonier i fasta medier.

2.3 design av PCR-primers

16S rDNA-sekvenserna av desulfomonas-och Desulfovibrio-stammar som finns tillgängliga i GenBank-databasen jämfördes med hjälp av Sequence Navigator-programvaran, version 1.0.1 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Det tillåtet att utforma sex primers för identifiering med PCR av SRB tidigare isolerade från människor, relaterade respektive till D. piger (tidigare desulfomonas pigra) ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577t, D. DESULFURICANS MB ATCC 27774 och D. fairfieldensis ATCC 700045. D. desulfuricans Essex 6 och D. DESULFURICANS MB differentierades eftersom 16S rDNA-sekvenser av dessa stammar uppvisar en skillnad på 3%. Primrarna var 27K-F (5′-CTG CCT TTG ATA CTG CTT AG-3′), 27K-R (5′-GGG CAC CCT CTC GTT TCG GAG A-3′), Essex-F (5′-CTA CGT TGT GCT AAT CAG CAG CGT AC-3′), Fair-F (5′-TGA ATG AAC TTT TAG GGG AAA GAC-3′), Pig-F (5′-CTA GGG TGT TCT AAT Cat Cat CCT AC-3′) och P687-r (5′-Gat ATC Tac gga TTT CAC TCC Tac ACC-3′) (Tabell 2). Specificiteten hos dessa primers kontrollerades på alla bakteriesekvenser tillgängliga från GenBank-databasen med Blast-programmet, version 2.0 (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA).

2.4 SRB identification by multiplex PCR

Four collection strains (D. piger ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774, and D. fairfieldensis ATCC 700045) and 12 clinical strains (two strains related to D. desulfuricans Essex 6, två stammar relaterade till D. DESULFURICANS MB och åtta stammar identifierade som D. fairfieldensis) användes som positiva kontroller. PCR: s känslighet utvärderades med utspädningar av kvantifierade bakteriella stamsuspensioner. PCR: s specificitet kontrollerades med negativa kontroller inklusive typstammar (Bilophila wadsworthia ATCC 49260T, Desulfovibrio gigas DSM 1382T, desulfovibrio vulgaris DSM 644T) och vanliga intestinala kliniska stammar som tillhör följande arter: Bacteroides spröda, Bacteroides merdae, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniform, Bacteroides vulgatus, Campylobacter jejuni, Citrobacter freundii, bakterier ofarliga, Enterobacter romerska riket, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, eubacterium liten, eubacterium klibbig, Fusobacterium nucleatum, Köpenhamn av kanalen, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Peptostreptococcus stor, Proteus underbar, Proteus vanlig, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, och Streptococcus bovis.

i slutet av inkubationstid, alla 151 inokulerade Test-kit Labège® kontrollerades med multiplex-PCR. DNA-extrakt erhölls från 500 occl odlingsmedier, efter centrifugering och resuspension i te–buffert (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8). Kortfattat lyserades cellerna med användning av successivt lysozym (3 mg ml−1), SDS (1%, w/v) och proteinas K (0,25 mg ml−1). Efter en inkubation över natten vid 37 kcal C extraherades DNA med standardfenol / kloroform / isoamylalkohol-metoden. Varje PCR-blandning på 50-oc innehöll 5 oc–l DNA-extrakt (cirka 50 ng DNA) och slutliga mängder av 0,4 oc-lm av varje primer, 0,8 mM av varje deoxynukleosidtrifosfat (Boehringer Mannheim Biochemicals, Mannheim, Tyskland), 0,4 mM Tris-HCl-buffert, 1,5 mM MgCl2 och 1,5 U av Taq DNA-polymeras (Gibco BRL Life Technologies, Paisley, UK). Alla reaktioner utfördes med användning av GeneAmp PCR-systemet 2400 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA). Ett första denatureringssteg på 94 C i 4 min följdes av 30 cykler av denaturering (94 C i 1 min), glödgning (55 C i 1 min) och förlängning (72 C i 2 min) och med en slutlig förlängning (72 C i 5 min). Negativa (vatten istället för DNA-extrakt) och positiva (D. fairfieldensis DNA-extrakt) kontroller inkluderades i varje körning. Förstärkta produkter löstes genom elektrofores i 1,5% (w/v) agarosgeler innehållande etidiumbromid (1,6 mg ml−1). En 100-BP DNA-stege användes som en storleksmarkör (Gibco BRL Life Technologies, Rockville, MD, USA). D. piger, D. desulfuricans Essex 6, D. DESULFURICANS MB och D. fairfieldensis identifierades med ett 255-, 255-, 396 – respektive 534-bp-band. D. piger och D. desulfuricans Essex 6 differentierades ytterligare genom separata PCR-analyser med användning av deras respektive specifika primers. För negativa prover utfördes 16S rDNA-förstärkning med konsensusprimrarna 27f och 1525r för att kontrollera frånvaron av hämning av PCR: erna genom föroreningar.

3 resultat

3.1 SRB-detektion och uppräkning

hos friska individer och enligt ovanstående kriterier hittades SRB i 10 avföring (24%) Med både test-kit Lab Exporge och Postgates medium. Hos patienter från Hepato-Gastro-Enterologienheten odlades SRB från 42 avföring med Postgates medium. Tre ytterligare prover hittades positiva med Test-kit labbet Uscug uscug. Således upptäcktes SRB bland de 110 patienter som studerades genom kultur hos 45 patienter (41%). Tre ytterligare prover gav tvetydiga resultat med Test-kit labbet sackaros (närvaro av en mörkbrun fällning). De genomsnittliga tiderna för detektering av tillväxten av SRB var 2 och 6 dagar med användning av test-kit Lab Exporge (intervall 1-11 dagar) respektive Postgates medium (intervall 3-39 dagar). Medelvärdet av SRB i avföring hos friska individer och patienter var 105 g−1 (intervall 102-109 g−1). Således var SRB-antalet inte relaterat till patienternas kliniska status.

3,2 SRB-identifiering med multiplex PCR

känsligheten för multiplex PCR-analysen var 100 bakterier per ml. Dess specificitet fastställdes genom frånvaron av korsreaktioner mellan de fyra genoarter som differentierades. Varje positiv kontroll befanns positiv enbart med motsvarande uppsättning primers. Alla stammar som användes som negativa kontroller för att kontrollera specificiteten, inklusive typstammarna av D. gigas och D. vulgaris, gav negativa resultat med de fyra primeruppsättningarna. Specificiteten av reaktionerna bekräftades ytterligare genom sekvensering av de förstärkta produkterna. De erhållna sekvenserna motsvarade alltid de förväntade. För SRB-negativa prover med PCR tillåts 16S rDNA-förstärkning att kassera möjligheten att hämma PCR: erna genom föroreningar.

hos patienter från Hepato-Gastro-Enterologiska enheten gav de 45 positiva och de tre tvetydiga avföringen positiva resultat med PCR. De motsvarade D. piger (n=33), D. fairfieldensis (n=14) eller båda (n=1). Inga D. desulfuricans bevisades (tabell 3). De kulturnegativa kolvarna var också negativa med PCR.

3.3 förhållande mellan desulfovibrio-arter och IBD

fördelningen av arten skilde sig inte signifikant vid jämförelse av friska individer och patienter med icke-inflammatoriska tarmsjukdomar. D. piger var knappt vanligare än D. fairfieldensis. Omvänt var D. piger hos patienter med IBD 4 gånger frekventare än D. fairfieldensis. Denna skillnad var särskilt märkbar för CD eftersom IBD-patienter huvudsakligen bestod av CD-patienter. Dessutom förekomsten av D. piger var signifikant högre hos patienter på sjukhus för IBD jämfört med friska individer eller patienter på sjukhus för andra patologier (P<0,05). Det fanns inget samband mellan sjukdomsstadiet och närvaron av SRB. Terapi förändrade inte isoleringshastigheten för dessa bakterier.

4 diskussion

närvaron av SRB i tarmkanalen hos djur och människor har erkänts under lång tid, även om identifieringar på artnivå sällan har utförts. Våra resultat bekräftar att dessa bakterier är vanliga invånare i människans tarmkanal. De flesta studier av intestinal SRB från IBD-patienter har förlitat sig på odlingsbaserad mikrobiologisk analys av fekala prover och har därför identifierat SRB på genusnivå . Nya studier har dock föreslagit att SRB: s möjliga roll i patogenesen av IBD kan vara relaterad till fysiologiska och/eller fylogenetiska skillnader mellan stammar av SRB . Således utarbetade vi en multiplex PCR för att identifiera dessa bakterier på artnivå. Med tanke på svårigheten att isolera och sällsyntheten hos specifika sökningar underskattas förekomsten av SRB i humana kliniska prover. Test-kit labbet, utvecklat för detektering av SRB från miljöprover, visade sig vara ett lämpligt medium för detektering av SRB från avföring såväl som från kroppsvätskor (Loubinoux, opublicerat resultat). Det har visats av tillverkaren att odla miljöstammar av SRB såsom D. desulfuricans DSM 1926, desulfotomaculum nigrificans DSM 574T, desulfobacter postgatei DSM 2034t och Desulfobulbus propionicus DSM 2032t. I våra händer visade det sig vara känsligare än det vanliga Postgates medium eftersom sex ytterligare isolat av Desulfovibrio detekterades hos patienter. Trots den rikliga åtföljande floran tillät Test-kit-labbet Uscubge uscub snabb tillväxt av SRB från avföringsprover, eftersom den genomsnittliga detekteringstiden var 2 dagar (jämfört med 6 dagar i Postgates medium). Detta kan vara relaterat till mediets kvalitet, men också till inokuleringsmetoden för prover som säkerställer upprätthållandet av strikt anaerobios. Jämfört med Postgates medium utvidgar tillsatsen av acetat till laktat detekteringsspektret till att inkludera långsamt växande acetatmetaboliserande SRB såsom Desulfobacter spp. Dessutom är närvaron av titancitrat, som är ett mycket effektivt reduktionsmedel (redoxpotentialen för Test-kit Lab-Exporten är cirka -600 mV), möjliggör en snabbare upptäckt av de flesta stammar av SRB.

det är möjligt att vissa stammar av SRB inte detekterades av test-kits labbet är övervuxna av den medföljande floran eller på grund av ett lågt antal prover. Test-kit labbet är dock anpassat till tillväxten av de flesta av SRB, och alla de positiva kolvarna identifierades med PCR som D. piger, D. fairfieldensis eller D. desulfuricans. Trots inkubationstiden på 2 månader bevisades inga ytterligare arter. Således är det möjligt att våra resultat motsvarar den verkliga mänskliga floran som nästan uteslutande består av D. piger och D. fairfieldensis. D. desulfuricans isolerades en gång och har också beskrivits hos människor i en tidigare studie , men det är sannolikt ovanligt i tarmkanalen. I de flesta fall, D. piger och D. fairfieldensis var ömsesidigt uteslutande. En förening av båda arterna observerades endast en gång i ett fall av koloncancer. För att bekräfta den nästan icke-överlappande förekomsten av D. piger och D. fairfieldensis, fem kolonier av SRB odlade i fast Postgates medium har identifierats med PCR för varje positivt Test-kit Labbubbixbg. I varje fall erhölls samma resultat och de fem kolonierna tillhörde samma art (data visas inte). Vi har också gjort en uppföljning av 10 patienter (fem SRB-positiva och fem SRB-negativa) i 2 månader och avföring odlades varje vecka. För varje patient erhölls samma resultat (SRB-positivt eller SRB-negativt) med alla prover (data visas inte). Det skulle dock vara intressant att följa patienterna med IBD under en längre tid för att avgöra om sjukdomsaktiviteten har en konsekvens på populationen av SRB.

D. desulfuricans är vanligtvis isolerad från miljön och har också betraktats som den vanligaste arten av desulfovibrio hos människor fram till den senaste beskrivningen av D. fairfieldensis. Således kan man bli förvånad över den mycket låga förekomsten av D. desulfuricans i vår befolkning. Hittills har D. piger och D. fairfieldensis isolerats enbart från mänskliga prover. Således visar våra resultat att båda arterna kan vara specifika för människans tarmkanal. Detta återstår emellertid att bestämmas av den specifika sökningen efter dessa bakterier i andra ekologiska nischer. D. piger har beskrivits endast en gång och betraktades som ett ovanligt fynd hos människor. Våra resultat tyder på att det kan vara den vanligaste SRB i tarmkanalen. Denna art har emellertid aldrig beskrivits i smittsamma processer. Tvärtom, D. fairfieldensis, tydligen mindre vanligt i mänskliga avföring, har isolerats utanför kolonlumen från blod och septiska samlingar . Således kan D. fairfieldensis ha ytterligare invasiva egenskaper jämfört med andra arter av Desulfovibrio, vilket skulle förklara dess återhämtning från kliniska prover. Intressant är att i vår serie patienter är förekomsten av D. piger i avföringen signifikant högre hos patienter som är inlagda för IBD (mestadels CD) än hos friska individer eller hos patienter som är inlagda för andra patologier. Detta kan ha två förklaringar: antingen D. piger har fysiologiska egenskaper som orsakar uppkomsten av lesioner och/eller deltar i fortsättningen av kroniska inflammatoriska processer, eller kolonisering av denna art gynnas av lokala förhållanden hos IBD-patienter. Föreningen av SRB med IBD har redan beskrivits . D. piger har inte beaktats ytterligare sedan dess första beskrivning 1976 . Således är upptäckten att denna bakterie, betraktad som en ’icke-patogen’ art, en vanlig invånare i det mänskliga tarmkanalen och den vanligaste arten av SRB hos IBD-patienter överraskande. Ytterligare studier bör genomföras för att belysa hur D. piger kan vara inblandad i dessa kroniska inflammatoriska processer.

erkännanden

detta arbete har delvis stödts av Compagnie Fran Exceptionaise de g Obboothermie (ORL Obboothermie, Frankrike) och av ett FCT-bidrag POCTI 36562/ESP/2000 till ICP. Vi är skuldsatta till den sena Dr. Wee Tee (University of Melbourne, Australien) för att vänligt tillhandahålla fyra stammar av D. fairfieldensis (inklusive stam ATCC 700045) och även till Prof.D. Raoult (University of Marseille, Frankrike) för att tillhandahålla en stam av D. fairfieldensis. Vi tackar D. Meng och A. M. Carpentier (Laboratoire de bact Brasiliriologie-Virologie UMR CNRS 7565) för deras utmärkta tekniska hjälp, Dr.A. Dao och Prof. B. Fortier för att tillhandahålla avföring från friska individer samt sjuksköterskorna i Hepato-Gastro-Enterologienheten för deras vänlighet.