Wolbachia-bakteriens roll i reproduktiva inkompatibiliteter och hybridzoner av Diabrotica-skalbaggar och Gryllus-syrsor

resultat och diskussion

Diabrotica är en ny världssläkt av chrysomelidbaggar som främst är neotropisk i sin distribution och vars ursprung sannolikt är regionen i Central-eller tropiska Sydamerika (28). Idag omfattar dess sortiment de flesta av USA öster om Rockies och norr om 35: e parallellen, staterna i Mexiko nordväst om Durango (exklusive Baja, CA), södra områden i Ontario, Kanada och en ny introduktion till Östeuropa (29). Fördelningen av D. V. zeae omfattar ett område från Guatemala i hela centrala Mexiko till Panhandle of Texas och delar av södra Oklahoma (28). Utvidgad majsproduktion kan också ha underlättat förflyttningen av D. V. zeae norrut från Mexiko, vilket resulterat i en region med sekundär kontakt med D. v. virgifera i norra Texas, där underarten hybridiserar (13).vuxna av D. V. zeae samplade från Stephenville och Uvalde i södra Texas var inte infekterade med Wolbachia medan vuxna av D. V. virgifera från 15 platser inom USA och kanadensisk distribution av D. V. virgifera testade positivt för Wolbachia, med undantag för två platser vid Duncan och Willcox, AZ. Tjugo vuxna från tre platser inom north Texas hybrid zone testade också positivt, inklusive fem exemplar med indexmönster inom variationsområdet för D. V. zeae (J. Krysan personlig kommunikation). Sekvenser av FtsZ-genen av Wolbachia från enskilda individer från Urbana, IL, Moriarty, NM och Blacksburg, VA, var identiska. Dessutom visade digestion med DraI av FtsZ-fragmentet erhållet med (i) allmänna B-specifika primers, (ii) ftsZf1 och (iii) ftsZr1 att populationer av D. V. virgifera från alla provtagna platser bär samma stam av Wolbachia. En fylogenetisk analys med användning av 16S rRNA-genen placerade denna stam i en basal position med ett olöst förhållande till andra Wolbachia-stammar (resultat visas inte). FtsZ-genen (23, 30) identifierade också Wolbachia från D. V. virgifera som en basal stam och skiljer sig från de flesta andra stammar i A-gruppen (Fig. 1). Med tanke på konsistensen av infektion och stamtyp genom distributionen av D. V. virgifera, liksom den snabba spridningen av denna art i Nordamerika, föreslår vi att infektionen inträffade i sydvästra USA eller nordvästra Mexiko före utvidgningen österut av D. V. virgifera i USA och Kanada. Den oinfekterade D. v. virgifera populationer i södra Arizona kan vara resterna av den ursprungliga oinfekterade befolkningen eller kan representera isolerade populationer som har förlorat infektionen.

D. V. virgifera och D. V. zeae är morfologiskt mycket lika (13), med undantag för svart elytral maculation som är distinkt i D. V. virgifera och begränsad till humerus eller är frånvarande i D. V. zeae. Underarterna är inte ekologiskt isolerade eftersom de båda finns på majs; de är inte heller temporärt isolerade eftersom de har samma diapause-mekanism. Beteendestudier indikerar inte några prematura hinder för reproduktion eftersom båda underarterna svarar på samma kön feromon och ingen diskriminering gjordes under parningsvalsexperiment (13). När de korsades var de två underarterna fertila i en riktning, dvs D. V. zeae-män från centrala Mexiko parade sig med D. V. virgifera-kvinnor från South Dakota medan det ömsesidiga korset producerade mycket få eller inga livskraftiga avkommor (14). För att testa om den enkelriktade inkompatibiliteten orsakas av Wolbachia-infektionen som identifierats i D. v. virgifera, vi gjorde ömsesidiga korsningar från infekterad och tetracyklinbehandlad D. V. virgifera. Resultaten indikerar att stammen av Wolbachia som infekterar D. V. virgifera kan inducera svår cytoplasmatisk inkompatibilitet, med endast 0,4% av 5627 ägg kläckning när infekterade D. V. virgifera-män korsades med tetracyklinbehandlade oinfekterade D. V. virgifera-kvinnor (Tabell 1, kors d).

vi etablerade också en laboratoriekoloni av D. V. zeae med prover från Stephenville, TX, och bekräftade att D. V. zeae-kvinnor korsade med D. V. Virgifera-män producerar mycket få eller inga avkommor medan det ömsesidiga korset resulterar i en normal ägglucka (tabell 1, korsar F och h) (14). När vi upprepade korsen med användning av tetracyklinbehandlade D. V. virgifera-män fanns inte inkompatibiliteten längre, och äggluckningshastigheter observerades som inte skilde sig signifikant från kontrollerna (Tabell 1, kors g), vilket bekräftar att den enkelriktade parningens inkompatibilitet mellan dessa två underarter orsakas av närvaron av Wolbachia i D. V. virgifera.

liknande reproduktiva inkompatibiliteter har också rapporterats mellan några medlemmar av släktet Gryllus i Nordamerika. Släktet Gryllus distribueras över större delen av världen med undantag för östra Asien och Stilla havet (31). Baserat på antalet arter är det möjligt att släktet härstammar i den nya världen eller Afrika, där flera släkter som liknar Gryllus har registrerats (32). I Nordamerika har släktet Gryllus flera närbesläktade arter, av vilka några är svåra att skilja på grundval av morfologiska tecken ensamma. I början av seklet betraktades denna grupp som en enda art med hög grad av variation (33). Efterföljande arbete huvudsakligen med att ringa låtar diskriminerade bland några av arterna (34).

flera arter i släktet Gryllus har visat sig vara enkelriktade eller Dubbelriktade oförenliga. Den enkelriktade inkompatibiliteten mellan G. pennsylvanicus-män och G. firmus-kvinnor i östra USA (19) speglar D. V. virgifera och D. V. zeae. Vi har funnit att, med undantag för G. firmus, exemplar från alla Gryllusarter som vi har studerat är vanligtvis infekterade med Wolbachia, ibland med mer än en stam (fikon. 2 och 3). De inkompatibiliteter som rapporteras mellan de olika arterna i detta släkt kan förklaras av infektion med denna bakterie. Vår studie har visat följande infektionsmönster. Populationer av G. heltal samplade från Humboldt County, NV, och Wayne County, UT, är infekterade med samma stam av Wolbachia bakterier, som vi kallar ”heltal typ.”Befolkningen som samplades i Davis, CA, var också infekterad med heltalstypen, med undantag för en individ som innehöll samma stam av Wolbachia som finns i G. rubens, som vi kallar ”rubens-typen.”Befolkningen som samplades i Las Cruces, NM, hade två individer som smittades med rubens-typen Wolbachia – stammen och tre individer som var dubbelt infekterade med rubens-och heltalstammarna. G. heltalspopulationerna i Austin och Dallas, TX, innehöll också samma bakteriestam, som på grundval av 16S rRNA-genen och FtsZ-genen verkar identisk med den som finns i G. rubens från Lake Placid och Gainesville, FL. Denna rubens-typ stam förekommer också i prover av G. ovisopis samplade från Gainesville. Vi kunde bara få exemplar av G. assimilis från laboratoriekulturerna av T. Walker och T. Zera; den senare kulturen härleddes från T. Walkers koloni. Individer från båda kulturerna infekterades med samma stam vars sekvens för FtsZ-genen var identisk med rubens-typen Wolbachia-stammen. 16S rRNA-genfragmentsekvensen indikerar att stammen i denna art har en transversion vid E. coli-position 380 från en guanin till en tymin, som i E. coli motsvarar den första positionen i tetraslingan GCAA. I” assimilis-typ ” – stammen består slingan av TAAA. Denna transversion finns inte i någon annan Wolbachia 16S rRNA-sekvens som hittills är känd.

populationen av G. pennsylvanicus visar ett mer komplext infektionsmönster. Under större delen av distributionen som vi har samplat är G. pennsylvanicus polymorf för infektionstyp. En population samplade i Lethbridge, Alberta, Kanada, visade närvaron av en Wolbachia-stam som skiljer sig från de som finns i G. rubens, G. assimilis, G. heltal och G. ovisopis. Vi hänvisar till denna stam som ”pennsylvanicus-typ” stam. Av 39 infekterade prover samplade från centrala Illinois, 38 hyste pennsylvanicus-typ stam medan ett prov Bar rubens-typ stam. En ort 150 km söderut, Farina, IL, visade en blandning av individer som smittades med antingen pennsylvanicus-typ eller rubens-typ stam eller med båda. Av två prover samplades Från Ann Arbor, MI, en bar rubens-typ stam, och den andra var dubbelt infekterad med pennsylvanicus – och rubens-Typ Stammar. För befolkningen som samplades i London, Ontario, Kanada, 215 km nordost om Ann Arbor, av 19 infekterade individer, 10 bar pennsylvanicus-typen, en bar rubens-typen och åtta var dubbelt infekterade med pennsylvanicus – och rubens-typstammar (Fig. 3a). Detta polymorfa mönster fortsätter i exemplar av G. pennsylvanicus samlad från Vermont och Pennsylvania. I Virginia och North Carolina upptäckte vi bara individer som smittades med antingen pennsylvanicus – eller rubens-typstammar. Befolkningen i G. pennsylvanicus i Nordamerika är en blandning av individer som är infekterade med rubens-typ eller pennsylvanicus-typ samt individer som är dubbelt infekterade med både stammar och individer som inte är infekterade (Fig. 3). Våra resultat hittills tyder på att, i populationer av G. pennsylvanicus i östra Nordamerika, rubens-typ infektion är vid en högre frekvens i norr än i söder (Fig. 3a). Dessutom har vi funnit att i de flesta orter där båda stammarna förekommer är dubbelt infekterade individer också närvarande (Fig. 2 och 3a).

som ett resultat av” drivningen ” associerad med spridningen av en Wolbachia – infektion (35) föreslår vi att den genetiska strukturen hos G. pennsylvanicus-populationer vi har samplat, exklusive Lethbridge, Kanada, har påverkats av närvaron av rubens-och pennsylvanicus-Typ Wolbachia-stammar. Därför ska vi hänvisa till G. pennsylvanicus-proverna som samlats in i dessa regioner som Gryllus nära (nr.) pennsylvanicus för att återspegla tvetydigheten i deras taxonomiska status som införts av infektionstyperna som finns i dessa populationer.

Vi har samplat G. firmus Från Gainesville och Archbold biologiska Station i Lake Placid, FL, och från Fort Fischer, NC. Trettiotvå av de 35 prover som samplades från dessa orter var oinfekterade. De tre infekterade individerna kom från Gainesville, FL. Två befanns bära rubens-typ, och den tredje Bar pennsylvanicus-Typ Wolbachia stam (Fig. 2 och 3a). Detta resultat tyder på att infektion av dessa två bakteriestammar rör sig in i populationerna av G. firmus, särskilt mot bakgrund av det faktum att G. pennsylvanicus inte är känt från Gainesville, FL.

analys av förhållandena mellan de olika stammarna vi har undersökt av Wolbachia i Gryllus-arten med hjälp av FtsZ – genen indikerar att heltal-och rubens-typstammar bildar en monofyletisk grupp och inte är nära besläktade med pennsylvanicus-typstammen, som är basal för alla andra B-grupp Wolbachia-stammar som hittills är kända. Stammen av Wolbachia rapporterad av Werren et al. (23) i G. pennsylvanicus är av rubens-typ (Fig. 2).

Vi föreslår att infektionerna i ovanstående medlemmar av släktet Gryllus ger en förklaring till de observerade parningsinkompatibiliteterna som erhållits av Smith och Cade (17), Cade och Tyshenko (18) och Harrison (19) och pekar på en möjlig roll av Wolbachia i speciering av vissa medlemmar av detta släkt. Den dubbelriktade inkompatibiliteten som observerats mellan G. rubens och G. integer är sannolikt resultatet av infektion med de två olika stammarna av Wolbachia som finns i dessa två arter. Kompatibiliteten hos G. rubens från Florida med G. heltal från Texas (17, 18) kan förklaras eftersom dessa populationer bär Rubens-typ bakterier. Våra data ger stöd till slutsatsen av Smith och Cade (17) Att G. rubens och G. integer från Texas kan vara samma art, trots skillnader i deras låtar av en grad som vanligtvis används för att skilja arter.

Med tanke på att G. pennsylvanicus är infekterad med Wolbachia och G. firmus är vanligtvis inte, kors som visar att G. pennsylvanicus-män är oförenliga med G. firmus-kvinnor (19) kan tolkas som ett resultat av cytoplasmatisk inkompatibilitet orsakad av Wolbachia. Vår tolkning underbyggs ytterligare av det mitokondriella mönstret som observerats i dessa två populationer, nämligen att G. firmus och G. pennsylvanicus har distinkta mitokondriella typer genom vilka dessa två populationer har identifierats; även om G. pennsylvanicus mtDNA lätt introgresses i befolkningen i G. firmus, det omvända förekommer inte (36). Detta mönster skulle observeras om G. pennsylvanicus är infekterad med Wolbachia eftersom majoriteten av individerna i hybridzonen skulle vara resultatet av avkomma av infekterade kvinnor, som i detta fall skulle bära G. pennsylvanicus mitokondriell typ tillsammans med den maternellt ärvda Wolbachia-infektionen.

den enkelriktade inkompatibiliteten mellan G. ovisopis-män, som bär Rubens-typbakterier, och G. firmus-kvinnor (T. Walker, personlig kommunikation) kan också tolkas mot bakgrund av denna infektion. Bristen på avkomma från korsningar mellan män av G. pennsylvanicus och G. ovisopis med kvinnor av G. firmus indikerar att dessa två stammar kan orsaka inkompatibilitet. Vi vet att G. ovisopis och G. rubens bär samma Wolbachia-stam, så den troliga orsaken till den dubbelriktade inkompatibiliteten som observerats mellan G. rubens och G. pennsylvanicus är de olika Wolbachia-stammarna de kan hysa.

med FtsZ-genen observerade vi 39 bp-skillnader mellan pennsylvanicus – och rubens-typstammarna, 41 skillnader mellan pennsylvanicus – och heltalstammarna och 22 skillnader mellan rubens-och heltalstammarna. För en jämförelse, i samma gensegment, finns det bara en basförändring mellan de Dubbelriktade inkompatibla Wolbachia-stammarna som finns i Drosophila simulans Hawaii och D. simulans Riverside (23). Baserat på detta bevis såväl som på inkompatibiliteterna som observerats i matningarna mellan respektive Gryllus-Art, förutspår vi att rubens -, heltal-och pennsylvanicus-typstammar är dubbelriktade oförenliga.hybridzonen mellan G. pennsylvanicus och G. firmus betecknad av Harrison och Arnold (20) är mer komplex än en art–art-interaktion. Några av de platser som vi samplade längs Blue Ridge och Appalachian mountains visar en ojämn fördelning av infektionstyper inom G. pennsylvanicus populationer (Fig. 3a). Således, i denna region, möjliga interaktioner kan förekomma mellan populationer av oinfekterade G. firmus, G. nr. pennsylvanicus infekterad med antingen rubens – eller pennsylvanicus-Typ Wolbachia och G. nr pennsylvanicus infekterad med både rubens – och pennsylvanicus-Typ Wolbachia stammar. Wolbachia-infektionen i Gryllus-arten som nämns och specifikt de flera infektionstyperna som finns i G. nr. pennsylvanicus population indikerar att begränsning av genflödet kan förekomma inom en population på grund av skillnader i infektionstyp. Den reproduktiva framgången för individer i dessa populationer beror på deras infektionsprofil såväl som hos de individer som de parar sig med. Vårt koncept om vad som utgör en art i släktet Gryllus måste utvärderas mot bakgrund av de Wolbachia-infektioner som de har.

infektioner med Wolbachia kan svepa genom en population som ett resultat av den fördel som infekterade kvinnor har över oinfekterade kvinnor (35). Med tanke på att G. pennsylvanicus och G. firmus har visat sig hybridisera i laboratoriet (19) och att det finns bevis för hybridisering i fältet (21), Den nuvarande fördelningen av G. firmus kan tolkas som en relikt, från ett bredare område genom vilket ett svep av en infekterad population rörde sig. En alternativ förklaring kan vara flera infektionsställen med samma Wolbachia-stam, men vi har ingen information om hur Wolbachia-bakterier överförs horisontellt över arter eller hur ofta de förvärvas. Därför väljer vi den mest parsimoniska förklaringen, att infektionen härstammar på en plats och därefter sprids. Faktum är att våra data tyder på att Wolbachia-infektionerna har en geografisk komponent och att rubens-typen härstammar i söder där den dominerar (Fig. 3a). Men i G. nr. pennsylvanicus-befolkningen i östra Nordamerika är infektionen av rubens-typ utbredd i populationer som samplas i norr. Dessa orter är de längsta punkterna från populationerna av Gryllus som är jämnt infekterade med rubens-typstammen och långt ifrån alla rapporterade G. rubens populationer (Fig. 3 a och b). Vi föreslår att infektionen av rubens – typ rörde sig genom befolkningen i Gryllus som fanns i östra Nordamerika före österutrörelsen av pennsylvanicus-typstammen.

i Gryllus-populationerna kan dubbelt infekterade individer vara resultatet av selektionstryck i en population där två bakteriestammar finns som är dubbelriktade oförenliga (Fig. 2 och 3a). I en sådan omständighet skulle individer som är dubbelt infekterade väljas för att, om båda infektionerna kan överleva i en cricket, skulle kvinnorna vara kompatibla med män som bär antingen bakteriestam. Ett tredje infektivt svep av dubbelt infekterade individer kan sedan uppstå genom befolkningen eftersom dubbelt infekterade kvinnor har en fördel jämfört med enstaka infekterade kvinnor, som bara kunde reproducera framgångsrikt med män infekterade med samma Wolbachia-stam. Flera infektioner har rapporterats från en mängd olika insektstaxa (37-39), och dubbelt infekterade män har visat sig vara delvis eller helt oförenliga med enstaka infekterade kvinnor i andra insekter (37-41). Vi förutspår att dubbla infektioner kan förekomma i orter där enstaka infektioner med två Dubbelriktade oförenliga stammar av Wolbachia förekommer i samma eller mycket närbesläktade taxa.

i en skärm av tempererade insekt taxa med PCR med specifika 16S rRNA primers fann vi att 16% av 615 insekt taxa, från en mängd olika familjer och order, infekterades med Wolbachia (rg och HMR, opublicerade data) och liknande infektionshastigheter har erhållits för tropiska insekter (42). Med tanke på denna infektionsfrekvens förutspår vi att andra insektshybridzoner kommer att befinnas definieras åtminstone delvis av Wolbachia-infektion och cytoplasmatisk inkompatibilitet. Vissa genera av insekter kan vara mer benägna att infektera med Wolbachia som en följd av deras naturhistoria. Speciering inom dessa grupper måste undersökas med avseende på Wolbachias Roll.