Chercheur principal: Zuben E. Sauna, PhD
Bureau / Division / Laboratoire: OTAT / DPPT / HB
Aperçu général
Un problème majeur des thérapies à base de protéines est leur immunogénicité, c’est-à-dire leur tendance à déclencher une réponse immunitaire indésirable contre eux-mêmes. Une forme de réponse immunitaire est l’activation des cellules B, qui produisent des anticorps qui se lient aux protéines et réduisent ou éliminent leurs effets thérapeutiques. De tels anticorps peuvent également entraîner des complications pouvant mettre la vie en danger. Par conséquent, une partie essentielle de la détermination de l’innocuité et de l’efficacité cliniques des produits thérapeutiques à base de protéines consiste à mesurer leur tendance à déclencher la formation d’anticorps.
La réponse immunitaire aux thérapies à base de protéines implique également des lymphocytes T, qui aident à activer les lymphocytes B afin qu’ils produisent des anticorps, y compris ceux qui bloquent les thérapies protéiques. Cela se produit si la protéine naturelle fabriquée par le corps est défectueuse d’une manière ou d’une autre. Dans ce cas, les lymphocytes T répondent à une protéine artificielle normale thérapeutique comme si elle était étrangère, car elle est différente de la protéine naturelle défectueuse. Une inadéquation de la réponse des lymphocytes T comme celle-ci se produit parfois dans le cas de la protéine FVIII, une protéine essentielle à la capacité du corps à former des caillots sanguins pour arrêter le saignement. Les personnes qui ne contiennent pas suffisamment de FVIII, ou dont le FVIII est défectueux d’une manière ou d’une autre, souffrent d’hémophilie A, une maladie dans laquelle la coagulation du sang est défectueuse et entraîne des saignements excessifs. Le problème du FVIII défectueux est d’origine génétique. Bien qu’il n’existe aucun remède contre l’hémophilie A, la perfusion de la protéine thérapeutique FVIII a été l’un des exemples les plus réussis de prise en charge d’une maladie chronique. Malheureusement, le développement d’anticorps anti-médicament contre le FVIII perfusé est un obstacle important à cette stratégie. Le traitement des patients qui développent une réponse immunitaire est plus complexe, moins efficace et extrêmement coûteux. Il apparaît maintenant que les variations individuelles de la tendance à développer des anticorps anti-médicaments peuvent également être basées sur des différences génétiques. Cela se reflète dans l’observation clinique selon laquelle les personnes atteintes d’hémophilie A d’ascendance africaine noire sont deux fois plus susceptibles que les patients d’ascendance caucasienne européenne de produire des anticorps contre les protéines du facteur VIII administrées en traitement de remplacement.
Une stratégie pour prévenir les incompatibilités entre le FVIII naturel et le FVIII de remplacement consiste à concevoir des protéines de FVIII génétiquement modifiées afin qu’elles ne déclenchent pas de réactions immunitaires. Mais il y a tellement de différences entre les systèmes immunitaires des personnes qu’il est peu probable que les chercheurs soient en mesure de concevoir une protéine FVIII qui soit sans danger pour tous. Nous proposons donc d’adopter une approche personnalisée pour prédire – et éviter – les réponses immunitaires aux protéines FVIII. Notre objectif à long terme est de développer une approche basée sur les gènes pour identifier les individus dont le système immunitaire est susceptible de réagir à des versions spécifiques de protéines thérapeutiques génétiquement modifiées afin que ces patients puissent être traités avec des versions de ces protéines moins susceptibles de provoquer des réponses immunitaires.
Nous abordons également le problème des différences dans les structures tridimensionnelles des protéines-médicaments et des protéines naturelles qui déclenchent les cellules B pour produire des anticorps contre les protéines thérapeutiques. La méthode actuelle pour prédire si certaines parties de ces protéines déclencheront la formation d’anticorps est difficile et coûteuse. Par conséquent, nous utilisons de minuscules morceaux de molécules ressemblant à de l’ADN appelés aptamères pour sonder les protéines et déterminer leurs formes exactes. Les aptamères sont constitués de chaînes de molécules appelées acides nucléiques qui se replient en formes spécifiques qui dépendent des acides nucléiques présents et de l’ordre dans lequel ils se produisent dans l’aptamère. Par conséquent, en identifiant quel aptamère se lie étroitement à une partie spécifique d’une molécule, nous pouvons prédire la forme de cette partie de la molécule, un peu comme prédire la forme d’une serrure en connaissant la forme de la clé qui s’y insère.
Nous utilisons maintenant cette technique pour déterminer les formes du FVIII et de la partie de la toxine du charbon appelée antigène protecteur. Si un aptamère perd sa capacité à se lier au FVIII, par exemple, cela indiquerait qu’une partie de cette protéine de coagulation du sang a changé de forme, augmentant la probabilité qu’elle déclenche une réaction immunitaire qui réduit son activité thérapeutique. Nous utilisons cette approche pour déterminer si les protéines thérapeutiques ont des formes qui déclencheront la production d’anticorps. Et nous collaborons avec le Centre d’évaluation et de recherche sur les médicaments pour adapter cette technologie afin d’analyser de nouveaux produits protéiques développés en tant que copies de médicaments protéiques approuvés existants (biosimilaires) pour nous assurer qu’ils seront sûrs et efficaces.
Aperçu scientifique
1) Prédire l’interaction des épitopes de lymphocytes T avec des antigènes spécifiques de classe II du CMH.
Le facteur VIII (FVIII) est un composant essentiel de la cascade de coagulation et les personnes déficientes en facteurs de coagulation présentent des troubles de la coagulation à vie. Le développement de l’immunogénicité contre les versions thérapeutiques (infusées) du FVIII est un obstacle important au succès du traitement des hémophiles.
Environ 50% des cas d’hémophilie A sont causés par une inversion des exons 1-22 du gène F, ce qui entraîne la production d’un polypeptide représentant ces exons, mais pas 23-26. Cependant, il existe un gène imbriqué dans le promoteur F8 qui traduit les exons 23-26. Néanmoins, l’inversion 1-22 signifie que les peptides qui se chevauchent générés à partir de cette protéine n’incluent pas la jonction entre 1-22 et 23-26. Alors que les peptides de la protéine médicament-FVIII infusée qui recouvrent cette jonction seraient donc étrangers au système immunitaire du patient, ils ne sont généralement pas immunogènes. Au contraire, l’immunogénicité due aux différences entre le FVIII endogène et le FVIII infusé est probablement due à une variété de faits, en particulier les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP), mais aussi les mutations et délétions fausses, et les mutations absurdes, ainsi que les inversions,
Par conséquent, la solution idéale (mais peu probable) au problème d’immunogénicité du FVIII infusé serait de concevoir des substituts du FVIII qui correspondent à l’haplotype et au type HLA de chaque patient pour éviter de déclencher une réponse immunitaire. Bien que la conception de tels produits biologiques pour correspondre à chaque patient ne soit pas pratique, cela pourrait être possible dans les cas où il existe des différences claires et significatives entre des populations spécifiques (par exemple, entre celles d’origine caucasienne européenne et d’origine africaine noire). Dans de tels cas, il serait souhaitable d’adapter les conceptions du FVIII endogène à chaque groupe pour s’assurer qu’une population ne bénéficie pas d’une part disproportionnée des avantages d’une seule version du FVIII alors que l’autre population supporte une part disproportionnée des risques du même FVIII infusé.
La technologie actuelle permet l’identification des arrière-plans d’haplotypes pour le FVIII ainsi que le développement d’au moins une gamme limitée de médicaments personnalisés à base de facteur VIII. Par conséquent, notre objectif à court terme est de déterminer la 1) distribution quantitative des différents haplotypes (SNP) chez les individus d’ascendance Européenne-caucasienne et Noire-africaine; 2) distribution des antigènes de classe II du CMH dans ces populations; 3) composition du FVIII utilisé comme médicaments; et 4) mutation, délétion ou inversion causant la maladie dans le gène F8 (FVIII) de patients individuels. Nous utiliserons ces données pour prédire l’immunogénicité de produits individuels contenant du FVIII dans différentes populations et/ou patients individuels.
2) Développement d’aptamères comme outil pour l’étude des épitopes conformationnels protéine-médicament.
Les aptamères, acides nucléiques capables de former des conformations complexes, sont des outils potentiels pour cartographier la conformation des protéines, l’identification et la prédiction des sites immunogènes, et pour contourner l’immunogénicité. Notre laboratoire développe des aptamères d’ADN monocaténaire en facteur VIII humain recombinant.
Nous avons conçu une bibliothèque d’ADN naïf pour générer des aptamères en utilisant des régions 5 et 3 définies pour la PCR flanquant une région randomisée à 60 bases. La banque d’ADN naÃve a été dénaturã©e et les segments d’adNSS ont été autorisés à se replier en des formes uniques en 3 dimensions. (Les 60 bases aléatoires entraîneraient théoriquement 460 conformères uniques.) Nous avons incubé le pool d’adNSS repliés avec du FVIII et grâce à des cycles SÉLEX itératifs (évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel), nous avons pu sélectionner des aptamères se liant aux protéines.
Notre laboratoire a sélectionné un échantillon d’aptamères individuels aux cycles 3, 5 et 8 et les a clonés et séquencés. Nous utilisons ces clones pour caractériser les aptamères par l’analyse de la structure 3D prévue, des propriétés de liaison et de l’effet sur l’activité du FVIII. De plus, nous faisons des comparaisons in silico de ces clones pour suivre l’évolution des aptamères.
3) Utilisation de diverses techniques analytiques pour évaluer les caractéristiques des protéines qui peuvent être en corrélation avec l’immunogénicité.
En collaboration avec les Drs. Mansoor Khan et Rakhi Shah (Division de la qualité des produits, CDER) analyseront les interactions des excipients médicamenteux à l’aide de méthodes thermiques (calorimétrie à balayage différentiel, microcalorimétrie, analyse thermogravimétrique), de techniques spectroscopiques (transformée de Fourier infrarouge, proche infrarouge, Raman), de cristallographie (diffraction des rayons X) et de résonance magnétique nucléaire.
4) Caractérisation des anticorps sensibles à la conformation.
Une méthode alternative à l’étude des épitopes conformationnels de protéines thérapeutiquement importantes consiste à développer et à caractériser des anticorps sensibles aux changements conformationnels. En collaboration avec le Dr Chava Kimchi-Sarfaty (CBER), nous avons caractérisé plusieurs anticorps sensibles à la conformation de la métalloprotéase de zinc ADAMTS13, une protéine multi-domaines qui clive le facteur von Willebrand et est impliquée dans le purpura thrombocytopénique thrombotique. Nos résultats suggèrent que ces anticorps pourraient être des réactifs utiles pour distinguer les ADAMTS13 fonctionnels et non fonctionnels, et pour analyser les transitions conformationnelles au cours du cycle catalytique.
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