mechanismus rezistence Escherichia coli vyvolané ampicilin v laboratoři

Úvod

Patogenní Escherichia coli často způsobuje průjem, sepse, a další klinické příznaky, a je stále jedním z hlavních střevní patogeny ovlivňující lidské zdraví a zdraví zvířat. Ampicilin (AMP), polosyntetická β-laktamová antibiotika, se široce používá k léčbě infekce E. coli u lidí a hospodářských zvířat, ale v poslední době se zvýšila jeho míra rezistence.1-3 AMP pracuje na aktivní replikační fázi bakterií, inhibuje syntézu bakteriální buněčné stěny. Bakterie často odolat takové antibiotika následujícími způsoby: kóduje β-laktamázy, změny cílový protein v buněčné stěně, snižuje propustnost vnější membrány, a zvyšuje expresi lékové efluxní pumpy. Antibakteriální léky se používají zvířata, a pak se rozšířil do prostředí prostřednictvím výkalů, který nejen dělá znečištěné prostředí, ale také přináší velké škody na lidském zdraví a udržitelný rozvoj odvětví chovu.4,5

bylo prokázáno, že sekvenování celého genomu (WGS) vede k prevenci a kontrole bakteriální rezistence.6 jednonukleotidový polymorfismus (SNP) se týká především sekvence DNA polymorfismus způsobené změny jediného nukleotidu na genomické úrovni, a resekvencování analýzy na obrazovce různé Modifikace mohou přímo studie lékové rezistence. Simulovali jsme proces klinických antibiotik v organismech pomocí metody laboratorní indukce AMP, a prozkoumal vztah mezi stupněm rezistence na léčivo a místem mutace. Screening pro non-synonymem jednonukleotidový polymorfismus (non-SNP) mezi rezistentních a citlivých kmenů pochopit roli non-SNP v rezistentních kmenů. Účelem této studie je pochopit zákon a mechanismus rezistence E. coli, stanovit nové cíle pro vývoj nových antibiotik, aby racionální používání antibiotik, a řešit více výskyt a léčba multi-drug rezistence E. coli v klinické praxi.

materiály a metody

bakteriální izoláty a činidlo

kmen E. coli použitý v této studii (e . coli 15743) byl izolován ze vzorku stolice od pacienta v nemocnici v Suixian, provincie Henan, Čína, v roce 2015. Charakterizace tohoto kmene metodou difúze papíru Kirby Bauer (K-B) ukázala, že kmen byl citlivý na osm tříd 20 antibiotik. E. coli ATCC 25922 byl použit jako kontrola pro naši studii.

M-H vývar střední a M-H pevná média (Oxoid společnost, UK), Farmaceutické citlivý papír (Hangzhou Binhe mikrobiální společnost, Hangzhou, Čína), AMP standardní produkty (Čínský lék identifikace Institute, Peking, Čína), DNA extraction kit (Shanghai Laifeng Biotechnologická společnost, Shanghai, Čína). Illumina Hiseq byla provedena v Shanghai Lingen Biotechnology Co., Ltd.

E. coli použitá v experimentu byla pro tuto studii specificky izolována. Studie byla schválena etickou komisí pro vědu o životě na univerzitě v Zhengzhou a pacient také podepsal písemný informovaný souhlas.

indukční proces

minimální inhibiční koncentrace (MIC) byla stanovena metodou ředění mikrobrotů.7-9 kmen bakterie E. coli (izolované z klinických a MIC hodnoty), který je citlivý na AMP byl kultivované na MH pevné médium, 37°C kultury po 18 až 24 hodinami, vybrat jednu kolonii v 8 mL M-H tekuté médium pro zesílení bakterií. Výše uvedené bakterie řešení bylo kultivované v M-H tekuté médium obsahující 1/2MIC AMP, respektive, a koncentrace AMP stále rostla během subkultury proces. Když koncentrace antibiotik dosáhla 16 µg / mL, pokaždé se zvýšila 8 µg/mL a každá koncentrace byla subkultivována dvakrát. Pokud byla hodnota změny MIC léčiva větší nebo rovna čtyřnásobku MIC před a po indukci, mělo se za to, že změna MIC po indukci měla významný význam.10 kultivační médium M-H vývaru bez antibiotik bylo použito jako kontrola během celého procesu.

Multilocus sequence typing (MLST) e. kmeny coli byly klasifikovány sedmi páry genů obsahujících adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA a recA.

testování Citlivosti

Kirby Bauer papír difúzní metoda byla použita na obrazovku E. coli, který byl citlivý na osm druhů antibiotik, včetně aminoglykosidy, peniciliny, cefalosporiny, tetracykliny, β-laktamázy inhibitory, karbamátů, sulfonamidy a chinolony. Indukované kmeny byly opakovány pomocí testu citlivosti na léky. Interpretace dat byla provedena v souladu s pokyny Clinical and Laboratory Standards Institute 2016.11.

za Prvé, jsme vyvolané E. coli rezistence k AMP, kultivaci E. coli s postupně zvýšit koncentraci AMP (2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, a 256 µg/mL). Poté, co jsme získané rezistence kmene, jsme ve srovnání odpor spektrum 20 antibiotik mezi indukované napětí (E. coli 15743-256, vyvolané na 256 µg/mL) a původní kmen (E. coli 15743) provedením drogové testy citlivosti. Bakteriální suspenze byla použita na agarovou desku, s malým kruhovým kousky papíru s různými antibiotiky a kultivovány při 37°C po dobu 16-20 hodin. Byl změřen průměr antimikrobiálního prstence.

WGS a resekvencování analýzy

napětí na hodnoty MIC 32 a 256 byl jmenován jako E. coli 15743-32 a E. coli 15743-256, resp. Analýza celého genomu byla provedena na primárních citlivých kmenech a resekvenování bylo provedeno na indukovaných rezistentních kmenech. Výsledky resekvencování byly porovnány s výsledky původní mapy. Screening non-SNP, které mohou ovlivnit funkci bílkovin.

sekvenování bylo provedeno společností Shanghai Ling ‚ en Biotechnology Co. Ltd. (Šanghaj, Čína). Illumina Hiseq v kombinaci s technologií sekvenování třetí generace byla použita k dokončení genomického sekvenování kmenů v tomto projektu.

RT-PCR

Odstranit zadní přepisována z DNA 4°C mrazáku a připravit požadovanou koncentraci činidla podle návodu. Zapněte přístroj ABI Fast7500, nastavte 95°C na 30 s, reagujte na 40 cyklů, 95°C na 3 s, 60°C na 30 s a křivku rozpusťte na 95°C na 15 s, 60°C na 60 s a 95°C na 15 s. Přidejte vzorek do 8řadé EP zkumavky, tři replikované jamky na vzorek a odstraňte bubliny centrifugací. Průměrná hodnota CT každého vzorku byla zaznamenána po dokončení reakce. Relativní úroveň exprese genu zájmu byla vypočtena pomocí 2-ΔΔCT. (ΔCT = CT hodnota cílového genu-CT hodnota interního referenčního genu. ΔΔCT = experimentální vzorek ΔCT-kontrolní skupina ΔCT.)

Bioinformatika analýza

SWISS-MODEL software byl použit k analýze sekvence aminokyselin proteinu kódovaného před a po mutaci genu, a předvídat proteinu terciární strukturu.12,13

Statistická analýza

SPSS17. 0 byla použita pro jednoduchou lineární regresní analýzu a byla testována regresní rovnice. Velikost testu byla 0,05 (α=0,05).

výsledky

výsledky testů citlivosti na léčivo

naše data ukázala, že E. coli 15743 byla citlivá na 20 různých antibiotik. Po indukci e. coli 15743-256 byl odolný vůči AMP, piperacilin, cefuroxim, cefazolin, cefoxitin, AMP/sulbaktam, amoxicilin/kyselina klavulanová, piperacilin/tazobaktam, a aztreonamu, ale stále citlivý na zbývajících 11 antibiotik (Tabulka 1, na Vědomí, že Zprostředkovatelé jsou také definována jako rezistence). Naše výsledky naznačily, že původní citlivé bakterie E. coli byl nejen vyvolané odolné vůči AMP, ale také rezistentní na řadu dalších antibiotik a stal multi-drug rezistentní během indukce.

Tabulka 1 Antibakteriální průměr kroužku Escherichia coli

výskyt lékové rezistence (stanovena hodnota MIC) během indukce

Ke studiu kinetiky rezistence, jsme kultivované bakterie E. coli se zvyšující se koncentrací AMP pro různá období a naměřené MIC při každé koncentraci, jak je uvedeno v Tabulce 2. Regresní analýza byla provedena na hodnotě MIC a indukční době pomocí SPSS 17.0. Regresní rovnice byla y=1,0435 lnx-0,7316. Byl vyhodnocen vhodný efekt rovnice, R2=0.9605, P<0.05. Hodnota MIC dosahující 32 µg/mL je kritická hodnota a hodnota MIC se zvýšila rychleji, než dosáhla 32 µg / mL než poté (Tabulka 2).

Tabulka 2 MIC hodnotu E. coli 15743 v průběhu času a indukované koncentraci

Mezitím, část s MIKROFONEM hodnotu menší než nebo rovna 32 µg/mL byl vybrán pro regresní analýzy a regresní rovnice byla y=0.0358 x+1.2812. Byl vyhodnocen vhodný efekt rovnice, R2=0.991, P<0.05. Hodnota MIC E. coli 15743 se zvyšovala se zvyšováním indukční koncentrace a doby indukce (Obrázek 1).

Obrázek 1 změna MIC hodnoty v průběhu času.Zkratka: MIC, minimální inhibičníkoncentrace.

MLST výsledky

prokázat, že indukované napětí (E. coli 15743-256) byl skutečně odvozen od původní kmen (E. coli 15743), jsme provedli MLST z výše uvedených dvou kmenů. Genomická DNA byla extrahována bakteriální DNA extraction kit, PCR amplifikována a sekvenována společností sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Blast vyhledávání NCBI databáze je uvedeno, že tyto dva kmeny mají stejné, MLST typ adk-13, fumC-363, gyrB-302, icd-97, mdh-17, purA-94, a recA-93. Naše data naznačují, že indukční proces nebyl kontaminován, a rezistentní kmen E. coli 15743-256 byl odvozen od citlivých kmen E. coli 15743.

analýza celého genomu

e. coli 15743 obsahovala 4408 genů, 22 rRNA a 85 tRNA. Hustota genu byla 0,945 kb, obsah GC byl 51.7%, gen procento bylo 88.3%, intergenic regionu délka byla 545,151, intergenic regionu GC obsahu byla 42,6%, a intergenic regionu tvořily 11,7% genomu. Charakteristiky genomů e. coli 15743 jsou shrnuty na obrázku 2. E. coli 15743 neobsahovala plazmidy.

Obrázek 2 genomické mapa E. coli 15743.Poznámky: nejvzdálenější kruh kruhové mapy je logo velikosti genomu, každá stupnice je 0,1 Mp. Druhý a třetí kruhy jsou CD na pozitivní a negativní řetězy a různé barvy označují různé COG klasifikace CD. Čtvrtý kruh je rRNA nebo tRNA. Pátý kruh je obsah GC a vnější červená část označuje, že obsah GC v oblasti je vyšší než průměrný obsah GC v celém genomu. Čím vyšší je špičková hodnota, tím větší je rozdíl od průměrného obsahu GC a vnitřní modrá část znamená, že obsah GC v oblasti je nízký. Pro průměrný obsah GC v celém genomu znamená vyšší vrchol větší rozdíl od průměrného obsahu GC. Nejvnitřnější kruh je hodnota zkosení GC. Specifický algoritmus je G-C nebo G+C. když je hodnota pozitivní v biologickém smyslu, pozitivní řetězec má tendenci přepisovat CDS. Když je negativní, negativní řetězec má tendenci přepisovat CD.Zkratka: COG, shluky Ortologních Skupinproteinu.

genomu mapa kmen zahrnuje rozložení genů na řetězy spravedlnosti a antisense, funkční klasifikace Klastrů Orthologous Skupin proteinů (COG), GC obsah, genom ostrov, a homologní geny, které mohou plně displej funkce genomu.

COG

funkční klasifikace COG e. coli 15743 ukázal, že většina genů se týkaly transport aminokyselin a metabolismu sacharidů transport a metabolismus, produkce energie a konverze, obecné funkce predikce pouze, anorganických iontů transport a metabolismus, a mobilní obálka biogeneze (Obrázek 3).

Obrázek 3 funkční klasifikace COG E. coli 15743.Zkratka: COG, shluky Ortologních skupin proteinů.

Non-Snp

určit, zda došlo ke změně v E. coli genomu po indukci původní kmen, provedli jsme celogenomové sekvenování vyvolané rezistentními kmeny (E. coli 15743-32 a E. coli 15743-256) a analyzovali počet mutací a místě mutace.

ve Srovnání s původním kmenem E. coli (E. coli 15743), tam byly devět non-Snp ve dvou vyvolané rezistentními kmeny, včetně tří sdílených non-Snp, které byly přítomny v genech orf00819, orf01200, a orf02235. Jiné non-SNP byly přítomny v genech orf01916, orf00490, orf03479, orf04094. V genu orf03479 se vyskytly tři mutace bez SNP a v každém ze zbývajících genů se vyskytla pouze jedna mutace SNP. Tři non-SNP byly v genech, které kódují proteiny buněčné membrány. Tři byly v genech s neznámými funkcemi. Jeden se týkal transportu a metabolismu anorganických iontů, jeden se týkal transkripce a jeden se týkal mechanismů přenosu signálu (Tabulka 3).

Tabulka 3 non-Snp výsledky analýzy E. coli 15743-32 a E. coli 15743-256

Naše data ukázala, že tam byly čtyři non-Snp v E. coli 15743-32, které byly na čtyři geny. V E. coli 15743-256 bylo osm Non-SNP, které se rozšířily do šesti genů. Funkční klasifikace COG ukázal, že většina genů se týkaly transport aminokyselin a metabolismu sacharidů transport a metabolismus, produkce energie a konverze, obecné funkce predikce pouze, anorganických iontů transport a metabolismus, a mobilní obálka biogeneze.

RT-PCR

Whole-genome re-sekvenování E. coli 15743-32 a E. coli 15743-256, fluorescenční real-time kvantitativní PCR detekce shody genů. Byly vyšetřeny geny, ve kterých se vyskytují Non-SNP, a E. coli 15743-32 A E. coli 15743-256 měl tři stejné geny (orf00819, orf01200, orf02235), a v úrovních exprese těchto genů v každé generaci napětí jsou zobrazeny na Obrázku 4A–C, resp.

Obrázek 4 Výsledky exprese mRNA v různých generacích kmenů.

RT-PCR ukázala, že orf01200, orf00819, orf02235 genů ukázal, vysoká exprese v rezistentní kmeny (E. coli 15743-32, E. coli 15743-64, E. coli 15743-128, E. coli 15743-256).

Proteinové struktury, predikce

terciární struktura se mění pouze proteiny kódované geny orf01200 a orf04094, a předpokládané výsledky jsou uvedeny na Obrázcích 5 a 6.

Obrázek 5 terciární struktura proteinu kódován orf01200 gen.Poznámky: A) před mutací; B) po mutaci.

Obrázek 6 terciární struktura proteinu kódován orf04094 gen.Poznámky: A) před mutací; B) po mutaci.

Před mutace orf01200, 2hrt.1.A byl vybrán jako referenční templátový protein (obrázek 5A). Modelová řada zbytkové infrastruktury byla 2-1033, sekvenční podobnost byla 0.59, a pokrytí šablony bylo 1.00. Po mutaci orf01200, 1iwg.1.A byl vybrán jako referenční templátový protein (obrázek 5B). Modelová řada zbytkové infrastruktury byla 7-1036, podobnost sekvence byla 0,59 a pokrytí šablony bylo 1,00.

před mutací orf04094, 4cti.1.B byl vybrán jako referenční templátový protein (obrázek 6A). Modelová řada zbytkové infrastruktury byla 184-436, podobnost sekvence byla 0,56 a pokrytí šablony bylo 0,59. Po mutaci orf04094, 3ib7.1.A byl vybrán jako referenční templátový protein (obrázek 6B). Modelová řada zbytkové infrastruktury byla 10-262, podobnost sekvence byla 0,33 a pokrytí šablony bylo 0,91.

Diskuse

Regresní analýza MIC a indukční čas ukázal, že MIC hodnota napětí zvýšena s nárůstem exogenní antibiotikum tlaku a indukce. Ukázali, že během indukce rezistence na e. coli imipenem se hodnota MIC časem zvyšovala.14 i když indukovaná koncentrace dosáhla 128násobku hodnoty MIC primárního kmene, indukce pokračovala a hodnota MIC se s indukcí dále zvyšovala. V souladu s výsledky této studie se hodnota MIC E. coli zvyšovala s časem a indukovanou koncentrací. Ukazuje, že pokud dávka není omezena, rezistence kmene bude stále vážnější.

AMP byla vyvolaná E. coli, 15743, pro 63 hodin (MIC dosáhl 32 µg/mL) a hodnota MIC byla osm krát citlivý kmen. Předtím se hodnota MIC rychle zvýšila, zatímco při indukci na hodnotu mic 32 µg / mL indukce pokračovala a rychlost růstu hodnoty MIC se snížila. Vzhledem k bakteriální rezistenci může dojít krátce před dosažením prahu rezistence na léčivo (hodnota MIC 32 µg / mL). Po dosažení kritické hodnoty mohou být bakterie líné a rostou pomalu, ale hodnota MIC se stále zvyšuje. Předpokládá se také, že tento kmen aktivuje určité mechanismy rezistence a mění stav rezistence bakterií na léky.

Zhang et al., ukázala, že chloramfenikol vyvolané citlivými Shigella léku odolné proti státu, a jeho lékové rezistence spektra změní.10 v důsledku toho byla Shigella nejen rezistentní na chloramfenikol, ale také rezistentní na jiné typy antibiotik. V souladu s výsledky této studie bylo spektrum rezistence E. coli na léky po indukci zesíleno. Výsledky ukázaly, že e. coli 15743-256 byl nejen odolný vůči AMP, ale také na piperacilin, cefuroxim, cefazolin, cefoxitin, AMP/sulbaktam, amoxicilin/kyselina klavulanová, piperacilin/tazobaktam, a aztreonamu byly také odolné. To je za to, že během indukcí E. coli tím, AMP, výraz systém AcrAB-TolC je aktivován, nebo více než jeden z více efluxní pumpy systémů je aktivován, a tam jsou jiné mechanizmy rezistence, jiné než efluxní mechanismus.

molekulární mechanismus bakteriální rezistence je stále nejasný. Za účelem zkoumání specifického molekulárního mechanismu e. coli rezistence na AMP, bakteriální WGS analýza byla provedena. Sekvenování výsledky byly porovnány s referenční sekvencí a 20 Snp byly promítány ze sekvence E. coli 15743-32, z nichž 4 byly non-synonymem Snp. Z kmene E. coli 15743-256 bylo vyšetřeno dvacet šest SNP, z nichž osm bylo nesynchronních SNP. Xiang et al., ukázala, že úroveň odolnosti proti mutantních kmenů byla vyšší než non-mutantní kmeny, a tam byl kvantitativní reakce mezi bodové mutace a bakteriální rezistence úrovně, a více genových mutací může zvýšit odolnost bakterií na antibiotika.15 v souladu s výsledky této studie, počet mutantních genů v E. coli 15743-32 byla menší než E. coli 15743-256, což naznačuje, že počet mutací může být ve vztahu ke stupni rezistence, a čím více mutací stránek, vyšší stupeň rezistence.

Po sekvenování, non-Snp promítán v tomto experimentu byly distribuovány v genech orf00490, orf00819, orf01916, orf01200, orf02235, orf03479, a orf04094. Mezi nimi jsou geny orf00490, orf00819 a orf01916 zapojeny do syntézy buněčné stěny. Popisy v KEGG jsou fumarát reduktázy podjednotku D (frdD), cell division protein ftsI (penicilin-binding protein 3) a porin vnější membránový protein OmpD, resp. Studie ukázaly, že frd gen kóduje FRD enzymu katalyzovat konverzi mezi fumarát reduktázy a sukcinát dehydrogenázy.16 bylo také zjištěno, že amplifikace genu frdD pomocí plazmidového vektoru může zvýšit výtěžek kyseliny jantarové.17,18 v kombinaci s touto studií se má za to, že gen frdD je zapojen do určitých metabolických drah, možná spojených s rezistencí AMP. V E. coli, hlavní cíle β-laktamová antibiotika jsou PBP1 (zachování buněčné morfologie), PBP2 (zachování E. coli napětí a rod tvar), a PBP3 (týkající se bakteriální divize). PBP3 je základní složkou proteinů buněčného dělení, které katalyzují zesítění peptidoglykanů buněčné stěny během buněčného dělení.19-22 Studie ukázaly, že down-regulaci OmpD bílkovin a OmpD genové exprese v bakteriální biofilmy vede ke snížení permeability buněčné membrány a zvýšená rezistence na antibiotika.23,24 v souladu s výsledky této studie, OmpD mutace genu spustí mechanismus bakteriální rezistence na β-laktamová antibiotika, a pokles v E. coli propustnost buněčné membrány je jedním z důvodů pro zvýšenou odolnost vůči AMP. Předpokládá se, že tyto změny ve funkci proteinů kódovaných geny zapojenými do syntézy buněčné stěny ovlivňují rezistenci bakterií na AMP.

Geny orf04094, orf01200, orf02235 jsou komentovaný v KEGG jako osmotický tlak snímače histidin kinázy (envZ), efluxní pumpu mnoha léků gen (acrB), a multi-drug resistance protein účastní transkripční regulace (marR). V posledních letech je aktivní efluxní mechanismus hlavním důvodem mnohočetné rezistence bakterií na léky.25-27, Protože většina odpadních vod systém transportuje substráty široce, a mnoho aktivních odpadních vod systémy mohou existovat ve stejné bakterie, tento systém může vést k bakteriální rezistence na různých antibakteriálních léků s naprosto odlišnou konstrukcí, konkrétně více odpor. V Marlen Adler studie, mutace v ftsI gen nedošlo k nárůstu antibiotické rezistence, vzhledem k tomu, že ftsI a envZ genové mutace, zvýšené MIC antibiotik několikrát. Cohen et al., ukázala, že funkce inhibiční protein kódovaný genem zmutoval MarR gen by být snížena, a účinek bakterií na více rezistence antibiotik byla malá, když MarR mutace byla detekována pouze.28 Merric et al, zjistili, že E. coli vykazovala pouze nízké hladiny rezistence na více léčiv, když byl gen MarR mutován.29 výsledky této studie ukázaly, že více genů bylo současně mutováno a E. coli rezistence na AMP se zvýšila.

Gen orf03479 je anotován jako valin glycin repeat g (vgrg) protein v KEGG. Typ VI Sekrece (Systém T6SS) je phage-související systém, který existuje v mnoha bakteriálních patogenů, jako je E. coli, Pseudomonas aeruginosa a Burkholderia cenocepacia. Efektorové faktory mohou být vylučovány do extracelulární bakterie a systém sekrece proteinů úzce souvisí s virulencí patogenních bakterií. Wang Jianfeng et al, ukázal, že mutace genu VgrG ovlivňuje toxicitu a lékovou rezistenci bakterií, ale funkce opakovaného proteinu glutamátu valinu je stále nejasná.30 Tato studie se domnívá, že gen VgrG může být spojen s rezistencí na AMP a jeho mechanismus vyžaduje další zkoumání.

Stručně řečeno, funkce COG těchto mutantních genů souvisí s původem buněčných membrán, transportem a metabolismem anorganických iontů, mechanismy transkripce a přenosu signálu. Studie ukázaly, že při antibiotickém stresu mohou bakterie přijmout aktivní obranu i pasivní obranu, aby zajistily jejich přežití.31 V pasivní obrany, bakterie se sám spící, snížení vitality života a blokovat kombinace antibiotik a cíl snížit zabíjení účinek antibiotik. V aktivní obrany, zvyšují aktivitu efluxní pumpy na zvýšení efluxu antibiotik a snížení akumulace antibiotik u bakterií, čímž se snižuje zabíjení účinek antibiotik na bakterie. Tato studie naznačuje, že rezistence E. coli na AMP je kombinací aktivních obranných systémů a systémů pasivní obrany. Rezistence na léčivo se může objevit krátce předtím, než hodnota bakteriálního MIC dosáhne prahu rezistence na léčivo. Geny frdD, ftsI, acrB, OmpD, marR, VgrG a envZ jsou spojeny s rezistencí AMP. Tyto studie pomohou zlepšit molekulární mechanismus E. coli rezistentní vůči β-laktamová antibiotika, a poskytnout výzkum základ pro prevenci a kontrolu multi-rezistentní bakterie a cíle nových antibiotik.

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.