hvis du hadde tilstrekkelig tid og et vibrasjonsfritt miljø, kunne du tålmodig vente og tyngdekraften ville bringe de fleste suspenderte partikler til bunnen av et sentrifugerør. De minste partiklene vil trolig forbli i suspensjon på grunn av brunisk bevegelse, og de fleste makromolekyler vil bli jevnt fordelt fordi de ville være i oppløsning i stedet for suspensjon. Jeg vet ikke om deg, men jeg har ikke den slags tålmodighet som trengs for å stole utelukkende på tyngdekraften for separasjon av faste fra flytende komponenter. Dessuten, for praktiske formål pellet du fikk ville være altfor lett forstyrret for effektiv separasjon av fast materiale fra supernatant. Gravity ville ikke være en veldig effektiv måte å skille suspenderte materialer basert på størrelse eller andre egenskaper.
Beskriver sentrifugeringsforhold
når du beskriver en sentrifugering kjøre i materialer og metoder, er det sjelden nødvendig å rapportere mer enn kraften, tid og temperatur av sentrifugering. Den nødvendige hastigheten (rpm) avhenger av sentrifugen og rotoren som brukes, som vil variere fra en lab til den neste. Dermed er det sjelden relevant å rapportere merke av sentrifuge, type rotor, eller hastighet.
sentrifugeringsprosessen
Sentrifugering produserer en sentripetal kraft som kan være mange hundre eller tusenvis av ganger tyngdekraften, og dermed påskynde prosessen betraktelig. Jo større antall omdreininger per minutt( RPM), desto større tyngdekraften. Nytten av sentrifugering i cellefraksjonering ville være begrenset hvis alt vi kunne gjøre er å kjøre suspenderte partikler til bunnen av et rør. Imidlertid er etterforskerne i stand til å kontrollere størrelsen på partikler som blir brakt ned, takket være partikkelens fysikk i suspensjon.
i en suspensjon av runde partikler med lik tetthet, men forskjellige diametre, er kraften som driver en gitt partikkel til bunnen, lik dens masse ganger den påførte akselerasjonen. Volumet av partikkelen er en funksjon av dens radius, og dens masse er lik dens volum ganger dens tetthetskoeffisient, som er en konstant. Volumet av en sfære er lik 4/3 ganger pi (en konstant) ganger kuben av radiusen. For en suspensjon av sfæriske partikler med like tettheter under et bestemt sett av forhold, er den eneste variabelen som bestemmer kraften på en gitt partikkel dens radius.
motstanden mot bevegelse gjennom en løsning er proporsjonal med den delen av overflaten som skyver gjennom mediet. For partikler av lignende form møter mindre partikler mindre motstand enn større. Siden overflatearealet til en sfære er 4 ganger pi ganger kvadratet av radiusen, og 4 ganger pi er en konstant, så for sfæriske partikler med lik sammensetning, er den eneste variabelen som bestemmer motstand under et gitt sett med forhold, partikkelens radius.
Drivkraften øker proporsjonalt med kuben av radiusen. Motstand mot bevegelse øker proporsjonalt med kvadratet av radiusen. Det er ikke vanskelig å se at når radiusen til en partikkel øker, øker dens tendens til å nærme seg bunnen også. Legg til en betydelig mengde ‘dra’, og tyngdekraften eksperimentet Som Har blitt tilskrevet Galileo fungerer ikke så bra, tross alt. Siden store partikler sediment raskere enn små partikler, kan en etterforsker skille store fra små organeller, celler, etc. bare ved å kontrollere tid og rpm av en sentrifuge kjøre.
Fraksjonering ved differensial sentrifugering
for et typisk cellehomogenat, en 10 min. spinn ved lav hastighet (400-500 x g) gir en pellet bestående av ubrutt vev, hele celler, cellekjerner og store rusk. Lav hastighet pellet er tradisjonelt kalt kjernefysiske pellet. En 10 min. spinn med moderat rask hastighet, noe som gir krefter på 10.000 til 20.000 x g, bringer ned mitokondrier sammen med lysosomer og peroksisomer. Derfor kalles den andre pellet i den tradisjonelle cellefraksjoneringsordningen mitokondriellpellet.
Videre cellefraksjonering ved differensial sentrifugering krever bruk av en ultracentrifuge. Et slikt instrument er utformet for å spinne rotorer ved høye vinkelhastigheter, for å generere svært høye g-krefter. Luften må pumpes ut av kammeret for å unngå varmeoppbygging på grunn av luftfriksjon. Faktisk er mange rotorer som er designet for en ultracentrifuge, ikke engang bygget aerodynamisk, siden de spinnes i vakuum. En times høyhastighets ultracentrifuge løp som genererer en kraft i størrelsesorden 80.000 x g gir en mikrosomal pellet. Mikrosomer inkluderer fragmenter av membran, inkludert cellemembran og endoplasmatisk retikulum. Membranfragmenter danner vesikler når de forstyrres i et vandig medium, så undersøkelsen vil avsløre mange membranvesikler av forskjellige størrelser. Vesiklene selv kan skilles på grunnlag av tetthet, på grunn av varierende proteininnhold. Men det er et emne for et annet dokument. Spinn i flere timer ved 150.000 x g eller så, og du kan få ned ribosomer og til og med den største av makromolekyler. Supernatanten som gjenstår består av oppløselige komponenter i cytoplasma, inkludert salter, små makromolekyler og forløpermolekyler og oppløste gasser.