RNases são como os super-heróis baddie entre as enzimas de laboratório. São omnipotentes, destrutivos e aparentemente indestrutíveis.isto é porque foram criados por soberanos malignos, com o único propósito de tornar a vida difícil para os cientistas corajosos que lutam todos os dias para produzir preps de ARN de alta qualidade e intactos.Ok, estou a brincar sobre a parte dos soberanos. Mas porque é que os RNases têm todos esses super poderes? E o que você pode fazer para derrotá-los? Vamos descobrir.
the super-powers of RNases, explained.
As RNases São omnipotentes
isto é verdade. RNases são encontradas em todos os tipos de células e organismos, desde procariontes até eucariontes. ou seja, estão em toda parte. Esta é uma das principais razões pelas quais eles são um problema no laboratório. Estão flutuando no ar, em cada superfície do seu corpo. O que significa que contaminam qualquer coisa que o ar, ou qualquer superfície do teu corpo tenha tocado. Que é basicamente tudo. Além disso, RNase A em particular adsorvida muito fortemente para o vidro, tornando ainda mais difícil para removê-lo de suas garrafas, etc.as RNases são altamente destrutivas, as RNases têm geralmente uma actividade específica muito elevada em relação ao seu substrato (ARN). Isto significa que a menor quantidade de RNase pode facilmente rasgar através de seus preps RNA preciosos. Incidentalmente, esta é também uma das razões pelas quais uma RNase (RNase A) foi a primeira enzima a ter o seu mecanismo de catálise deduzido (Findlay et al 1962).
RNases são aparentemente indestrutíveis
elas exibem uma recuperação como a Fênix após autoclavagem
sabedoria convencial diz que se você autoclave RNases, elas denaturam, mas então renaturam e re-ganham função parcial após o resfriamento. Esta incrível e lendária fortaleza é possibilitada por uma série de ligações dissulfureto intramoleculares que mantêm a estrutura intacta, mesmo após as ligações de hidrogênio que normalmente mantêm a estrutura protéica 3D no lugar serem quebradas. Como todas as fábulas, isto é verdade até certo ponto. Mas continue a ler e descobriremos que este super-poder em particular foi exaltado pelos spin doctors da RNase Baddies Inc.nem a EDTA os consegue parar!
Ao contrário de outras nucleases, muitas RNases não necessitam de íons metálicos para catálise, uma vez que elas usam o grupo hidroxilo 2-prime do substrato de ARN como uma espécie reativa, então simplesmente adicionando TE não as inibe, como faria para nucleases de munição de DNA.não se preocupe, colega cientista. Os RNases podem ser inimigos formidáveis, mas têm fraquezas que podemos explorar.
Kick them in the H’S
RNases rely on histidina residues in their active site for catalysis. Assim, o pirocarbonato de dietilo (DEPC), que é um Agente alquilante específico da histidina, pode inativá-los. A autoclavagem irá então remover o RCP para impedi-lo de alcalinizar quaisquer outras proteínas em si, ou nas suas amostras.
Autoclaving funciona, em uma extensão
A muito lendária indestrutibilidade das RNases em face da autoclavagem é verdadeiro no núcleo, mas também muito hiped, como eu mencionei acima. Um pequeno estudo de Ambion mostrou que as RNases (ou RNase A, pelo menos) não são completamente resistentes à autoclavagem. Em vez disso, sua atividade é dizimada por autoclavagem, mas uma pequena parte da atividade RNase permanece após autoclavagem.
mas se o curso uma pequena quantidade de RNAse ainda tem um monte de Rna munching poder. Isto significa que a autoclavagem de rotina como parte de seus procedimentos de descontaminação RNase certamente vale a pena – é apenas que você não pode confiar nele para remover toda a atividade.
eles não conseguem suportar o calor (seco)
enquanto o calor húmido (autoclavagem) destrói parcialmente as RNAses, não há esperança de que eles resistam ao calor seco. O calor seco oxida as RNAses-qualquer outra proteína, por mais robustas que sejam. Por isso, para limpar o seu material de vidro, um par de horas a 180 degC deve bastar.
guerra química
para as superfícies de limpeza, as RNAses, por mais robustas que sejam, não podem suportar coisas como peróxido de hidrogénio, ácidos / bases fortes, Trizol, etc. Estes são todos comumente usados para se livrar até mesmo dos RNases mais difíceis.Kryptonite para as RNases: Inibidores
talvez a melhor arma que temos no nosso arsenal contra as RNAses sejam inibidores da RNase. Mais comumente, inibidores commerciais da RNase são versões de inibidores da ribonuclease placentária (RI). Como alguém que passa um ano a tentar aperfeiçoar hibridizações in situ sem a ajuda de um inibidor da RNase (devido a uma economia falsa do meu chefe!), I know just how good this RNase Kryptonite is. Um microlitro de RI e, de repente, as minhas experiências começaram a funcionar.
eu digo que isso é a melhor arma em nosso arsenal contra RNases porque, ao contrário de todas as outras soluções listadas acima, RNase inibidores são específicos, de modo que você pode (geralmente) colocá-los onde ele conta em seu fluxo de trabalho e obter a proteção que você precisa do mal. Não fique sem estas coisas se você estiver trabalhando com RNA.isto ajudou-o? Então, por favor, partilhe com a sua rede.