RNases er som baddie superhelte blandt laboratorie-symboler. De er almægtige, destruktive og tilsyneladende uforgængelige.
dette skyldes, at de blev skabt af onde overherrer, med det ene formål at gøre livet vanskeligt for de modige forskere, der kæmper hver dag for at producere intakte RNA-preps af høj kvalitet.
Ok, Jeg laver sjov om overlords-delen. Men hvorfor har RNases alle disse superkræfter alligevel? Og hvad kan du gøre for at besejre dem? Lad os finde ud af det.
rnases superkræfter, forklaret.
Rnaser er allmægtige
Dette er sandt. Rnaser findes i alle celletyper og organismer fra prokaryoter til eukaryoter. dvs. de er overalt. Dette er en af hovedårsagerne til, at de er et sådant problem i laboratoriet. De flyder i luften på alle overflader af din krop. Hvilket betyder, at de forurener alt, hvad luften eller enhver overflade af din krop har rørt. Hvilket er dybest set alt. Også, RNase a især adsorberer meget stærkt til glas, hvilket gør det endnu sværere at fjerne det fra dine flasker osv.
Rnaser er meget destruktive
Rnaser har generelt en meget høj specifik aktivitet over for deres substrat (RNA). Dette betyder, at den mindste mængde RNase let kan rippe gennem dine dyrebare RNA-preps. I øvrigt er dette også en af grundene til, at en RNase (RNase a) var den første, der fik sin katalysemekanisme udledt (Findlay et al 1962).
Rnaser er tilsyneladende uforgængelige
de viser en føniks-lignende genopretning efter autoklavering
Convential visdom siger, at hvis du autoklaverer Rnaser, denaturerer de, men derefter renaturerer og genvinder delvis funktion efter afkøling. Denne fantastiske, sagnomspundne styrke er aktiveret af en række intramolekylære disulfidbindinger, der holder strukturen intakt, selv efter at hydrogenbindingerne, der normalt holder 3D-proteinstrukturen på plads, er brudt. Som alle fabler er dette sandt i et omfang. Men læs videre, så finder vi ud af, at netop denne supermagt er blevet hypet op af spin-lægerne hos RNase Baddies Inc.
selv EDTA kan ikke stoppe dem!
I modsætning til andre nukleaser kræver mange Rnaser ikke metalioner til katalyse, da de bruger 2-prime hydroksyl-gruppen af RNA-substratet som en reaktiv art, så blot at tilføje TE hæmmer dem ikke, som det ville for DNA-munching nukleaser.
Sådan besejrer du de onde Rnaser
må ikke bekymre dig, medforsker. RNases kan være formidable fjender, men de har svagheder, som vi kan udnytte.
spark dem i H ‘ erne
Rnaser er afhængige af histidinrester på deres aktive sted til katalyse. Så diethylpyrocarbonat (DEPC), som er et histidin-specifikt alkyleringsmiddel, kan inaktivere dem. Autoklavering fjerner derefter DEPC for at forhindre det i at alkalisere andre proteiner i dig eller dine prøver.
autoklavering fungerer i en grad
den meget sagnomspundne uforgængelighed af Rnaser i lyset af autoklavering er sandt i kernen, men også meget overhypet, som jeg nævnte ovenfor. En dejlig lille undersøgelse fra Ambion viste, at Rnaser (eller RNase A i det mindste) ikke er fuldstændig resistente over for autoklavering. Snarere decimeres deres aktivitet ved autoklavering, men en lille del af Rnaseaktiviteten forbliver efter autoklavering.
men hvis selvfølgelig en lille mængde RNAse stadig har en masse RNA munching magt. Dette betyder, at rutinemæssig autoklavering som en del af dine RNase – dekontamineringsprocedurer bestemt er værd-det er bare, at du ikke kan stole på det for at fjerne al aktiviteten.
de kan ikke tåle den (tørre) varme
mens våd varme (autoklavering) delvist ødelægger Rnaser, er der intet håb om, at de modstår tør varme. Tørvarme ilter Rnaser – ethvert andet protein, uanset hvor robust de er. Så for at rengøre dit glas, skal et par timer ved 180 degC gøre det.
kemisk krigsførelse
til rengøring af overflader, Rnaser, så robuste som de er, kan ikke tåle ting som brintoverilte, stærke syrer / baser, Trisol osv. Disse er alle almindeligt anvendt til at slippe af med selv de hårdeste RNases.Kryptonit til Rnaser: Inhibitorer
måske er det bedste våben, vi har i vores arsenal mod Rnaser, Rnasehæmmere. Oftest er kommercielle Rnasehæmmere versioner af placental ribonuklease inhibitor (RI). Som en person, der bruger et år på at forsøge at perfektionere RNA in situ hybridiseringer uden hjælp af en Rnasehæmmer (på grund af en falsk økonomi af min chef!), Jeg ved lige hvor god denne RNase Kryptonit er. En mikroliter RI og pludselig begyndte mine eksperimenter at arbejde.
Jeg siger, at dette er det bedste våben i vores arsenal mod Rnaser, fordi I modsætning til alle de andre løsninger, der er anført ovenfor, er Rnasehæmmere specifikke, så du kan (generelt) placere dem lige, hvor det tæller i din arbejdsgang og få den beskyttelse, du har brug for fra de onde. Vær ikke uden disse ting, hvis du arbejder med RNA.
har dette hjulpet dig? Så del venligst med dit netværk.