dacă ai avea suficient timp și un mediu fără vibrații, ai putea aștepta cu răbdare și forța gravitațională ar aduce majoritatea particulelor suspendate pe fundul unui tub de centrifugă. Cele mai mici particule ar rămâne probabil în suspensie datorită mișcării browniene, iar majoritatea macromoleculelor ar fi distribuite uniform, deoarece ar fi mai degrabă în soluție decât în suspensie. Nu știu despre tine, dar nu am Tipul de răbdare necesar pentru a mă baza exclusiv pe gravitație pentru separarea componentelor solide de lichide. În plus, în scopuri practice, peleta pe care ați obținut-o ar fi mult prea ușor perturbată pentru separarea eficientă a materialului solid de supernatant. Gravitația nu ar fi o modalitate teribil de eficientă de separare a materialelor suspendate pe baza dimensiunii sau a altor caracteristici.
descrierea condițiilor de centrifugare
când decriptați o centrifugare rulată în materiale și metode, rareori este necesar să raportați mai mult decât forța, timpul și temperatura centrifugării. Viteza necesară (rpm) depinde de centrifuga și rotorul utilizat, care vor varia de la un laborator la altul. Astfel, rareori este relevant să se raporteze marca centrifugei, tipul rotorului sau viteza.
procesul de centrifugare
centrifugarea produce o forță centripetă care poate fi de multe sute sau mii de ori forța gravitațională, accelerând astfel procesul considerabil. Cu cât este mai mare numărul de rotații pe minut (RPM), cu atât este mai mare forța gravitației. Utilitatea centrifugării în fracționarea celulelor ar fi limitată dacă tot ce am putea face este să conducem particule suspendate pe fundul unui tub. Cu toate acestea, anchetatorii sunt capabili să controleze dimensiunea particulelor care sunt reduse, datorită fizicii particulelor în suspensie.
într-o suspensie de particule rotunde de densitate egală, dar diametre diferite, forța care conduce o particulă dată la fund este egală cu masa sa de ori accelerația aplicată. Volumul particulei este o funcție a razei sale, iar masa sa este egală cu volumul său ori coeficientul său de densitate, care este o constantă. Volumul unei sfere este egal cu 4/3 ori pi (o constantă) ori cubul razei. Pentru o suspensie de particule sferice de densități egale într-un set specific de condiții, singura variabilă care determină forța asupra unei particule date este raza acesteia.
rezistența la mișcare printr-o soluție este proporțională cu acea parte a suprafeței care împinge prin mediu. Pentru particulele de formă similară, particulele mai mici întâmpină o rezistență mai mică decât cele mai mari. Deoarece suprafața unei sfere este de 4 ori pi ori pătratul razei și de 4 ori pi este o constantă, atunci pentru particulele sferice cu compoziție egală, singura variabilă care determină rezistența într-un set dat de condiții este raza particulei.
forța motrice crește proporțional cu cubul razei. Rezistența la mișcare crește proporțional cu pătratul razei. Nu este dificil să vedem că, pe măsură ce raza unei particule crește, tendința sa de a se apropia de fund crește, de asemenea. Adăugați o cantitate semnificativă de’ tragere’, iar experimentul gravitațional care a fost atribuit lui Galileo nu funcționează atât de bine, la urma urmei. Deoarece particulele mari sedimentează mai rapid decât particulele mici, un investigator poate separa organele mari de cele mici, celulele etc. pur și simplu prin controlul timpului și rpm de o centrare centrifugă.
Fracționarea prin centrifugare diferențială
pentru un omogenat celular tipic, a 10 min. rotirea la viteză mică (400-500 x g) produce o peletă formată din țesut neîntrerupt, celule întregi, nuclee celulare și resturi mari. Peleta cu viteză mică este denumită în mod tradițional peleta nucleară. A 10 min. spin la o viteză moderat rapidă, producând forțe de 10.000 până la 20.000 x g reduce mitocondriile împreună cu lizozomii și peroxizomii. Prin urmare, a doua peletă din schema tradițională de fracționare a celulelor se numește peletă mitocondrială.
fracționarea suplimentară a celulelor prin centrifugare diferențială necesită utilizarea unui ultracentrifuge. Un astfel de instrument este conceput pentru a roti rotoarele la viteze unghiulare mari, pentru a genera forțe g foarte mari. Aerul trebuie pompat din cameră pentru a evita acumularea de căldură din cauza frecării aerului. De fapt, multe rotoare care sunt proiectate pentru un ultracentrifuge nu sunt nici măcar construite aerodinamic, deoarece sunt rotite în vid. O cursă ultracentrifugă de o oră de mare viteză care generează o forță de ordinul a 80.000 x g produce o peletă microzomală. Microzomii includ fragmente de membrană, inclusiv membrana celulară și reticulul endoplasmatic. Fragmentele de membrană formează vezicule atunci când sunt perturbate într-un mediu apos, astfel încât examinarea ar dezvălui numeroase vezicule de membrană de diferite dimensiuni. Veziculele în sine pot fi separate pe baza densității, datorită conținutului diferit de proteine. Dar acesta este un subiect pentru un alt document.
Spin pentru câteva ore la 150.000 x g sau cam asa ceva, și puteți aduce în jos ribozomi și chiar cea mai mare de macromolecule. Supernatantul care rămâne constă din componente solubile ale citoplasmei, inclusiv săruri, macromolecule mici și molecule precursoare și gaze dizolvate.