RNases sunt ca super-eroii baddie printre enzimele de laborator. Ele sunt omnipotente, distructive și aparent indestructibile.
acest lucru se datorează faptului că au fost create de stăpâni răi, cu unicul scop de a face viața dificilă pentru oamenii de știință curajoși care se luptă în fiecare zi pentru a produce preparate ARN intacte de înaltă calitate.
OK, glumesc despre partea cu stăpânii. Dar de ce RNases au toate aceste super-puteri oricum? Și ce poți face pentru a le învinge? Să aflăm.
super-puterile Rnazelor, a explicat.
ARN-urile sunt Omnipotente
Acest lucru este adevărat. Arnazele se găsesc în toate tipurile de celule și organisme, de la procariote la eucariote. adică sunt peste tot. Acesta este unul dintre principalele motive pentru care sunt o astfel de problemă în laborator. Ele plutesc în aer, pe fiecare suprafață a corpului tău. Ceea ce înseamnă că ele contaminează tot ceea ce aerul sau orice suprafață a corpului tău a atins. Care este practic totul. De asemenea, RNase a în special adsorbs foarte puternic la sticlă, ceea ce face chiar mai greu pentru a elimina din sticle etc.
ARN-urile sunt foarte distructive
ARN-urile au în general o activitate specifică foarte mare față de substratul lor (ARN). Acest lucru înseamnă că cea mai mică cantitate de RNase poate rupe cu ușurință prin Prep-urile dvs. prețioase de ARN. De altfel, acesta este și unul dintre motivele pentru care o Rnază (Rnaza A) a fost prima enzimă care a dedus mecanismul său de cataliză (Findlay et al 1962).
ARN-urile sunt aparent indestructibile
afișează o recuperare asemănătoare Phoenix-ului după autoclavare
înțelepciunea Convențială spune că, dacă Autoclavați ARN-urile, acestea denaturează, dar apoi renatură și re-câștigă funcția parțială după răcire. Această forță uimitoare și fabuloasă este activată de o serie de legături disulfidice intramoleculare care mențin structura intactă, chiar și după ce legăturile de hidrogen care dețin în mod normal structura proteinei 3d sunt rupte. Ca toate fabulele, acest lucru este adevărat într-o măsură. Dar citiți mai departe și vom afla că această super-putere specială a fost exagerată de medicii de spin de la RNase Baddies Inc.
nici EDTA nu-i poate opri!
spre deosebire de alte nucleaze, multe ARN-uri nu necesită ioni metalici pentru cataliză, deoarece folosesc gruparea hidroxil 2-prim a substratului ARN ca specie reactivă, astfel încât simpla adăugare a TE nu le inhibă, așa cum ar fi pentru nucleazele care mănâncă ADN.
cum de a învinge rnases rele
nu se agita, colegi de știință. Rnazele pot fi dușmani formidabili, dar au slăbiciuni pe care le putem exploata.
introduceți-le în H
ARN-urile se bazează pe reziduurile de histidină din situsul lor activ pentru cataliză. Astfel, pirocarbonatul de dietil (DEPC), care este un agent de alchilare specific histidinei, le poate inactiva. Autoclavarea va elimina apoi DEPC pentru a opri alcalinizarea oricăror alte proteine din tine sau din probele tale.
autoclavarea funcționează, într-o măsură
indestructibilitatea mult legendară a ARN-urilor în fața autoclavării este adevărată la bază, dar și foarte exagerată, așa cum am menționat mai sus. Un mic studiu frumos de la Ambion a arătat că Rnazele (sau cel puțin Rnaza a) nu sunt complet rezistente la autoclavare. Mai degrabă activitatea lor este decimată prin autoclavare, dar o mică parte din activitatea Rnazei rămâne după autoclavare.
dar dacă desigur o cantitate mică de RNAse are încă o mulțime de ARN ronțăind putere. Aceasta înseamnă că autoclavarea de rutină ca parte a procedurilor de decontaminare RNase este cu siguranță utilă – doar că nu vă puteți baza pe ea pentru a elimina toată activitatea.
nu pot suporta căldura (uscată)
în timp ce căldura umedă (autoclavarea) distruge parțial ARN-urile, nu există nicio speranță ca acestea să reziste căldurii uscate. Căldura uscată oxidează Arnazele – orice altă proteină, indiferent cât de robuste sunt. Deci, pentru curățarea sticlăriei, câteva ore la 180 degC ar trebui să o facă.
războiul chimic
pentru curățarea suprafețelor, Arnazele, oricât de robuste sunt, nu suportă lucruri precum peroxidul de hidrogen, acizii / bazele puternice, Trizolul etc. Acestea sunt toate utilizate în mod obișnuit pentru a scăpa chiar și de cele mai dure RNase.
kryptonita pentru ARN-uri: Poate că cea mai bună armă pe care o avem în arsenalul nostru împotriva Arnazelor este inhibitorii de Arnază. Cel mai frecvent, inhibitorii rnazei comerciale sunt versiuni ale inhibitorului ribonucleazei placentare (ri). Ca cineva care petrece un an încercând să perfecționeze hibridizările ARN in situ fără ajutorul unui inhibitor de Rnază (din cauza unei economii false a șefului meu!), Știu cât de bună este această kryptonită RNase. Un microlitru de RI și dintr-o dată experimentele mele au început să funcționeze.
eu spun că aceasta este cea mai bună armă în arsenalul nostru împotriva RNases, deoarece, spre deosebire de toate celelalte soluții enumerate mai sus, inhibitorii RNase sunt specifice, astfel încât să puteți (în general) le-a pus chiar în cazul în care contează în fluxul de lucru și pentru a obține protecția de care aveți nevoie de cele rele. Nu fi fără aceste lucruri dacă lucrați cu ARN.
te-a ajutat asta? Apoi, vă rugăm să partajați cu rețeaua.