om du hade tillräckligt med tid och en vibrationsfri miljö kan du tålmodigt vänta och tyngdkraften skulle föra de flesta suspenderade partiklar till botten av ett centrifugrör. De minsta partiklarna skulle förmodligen stanna i suspension på grund av brunisk rörelse, och de flesta makromolekyler skulle fördelas jämnt eftersom de skulle vara i lösning snarare än suspension. Jag vet inte om dig, men jag har inte den typ av tålamod som behövs för att förlita sig enbart på gravitation för separation av fasta från flytande komponenter. Dessutom, för praktiska ändamål skulle pelleten du fick vara alltför lätt störd för effektiv separation av fast material från supernatant. Gravity skulle inte vara ett fruktansvärt effektivt sätt att separera suspenderade material baserat på storlek eller andra egenskaper.
beskrivning av centrifugeringsförhållanden
När en centrifugering körs i material och metoder är det sällan nödvändigt att rapportera mer än centrifugeringens kraft, tid och temperatur. Den erforderliga hastigheten (rpm) beror på centrifugen och rotorn som används, vilket kommer att variera från ett laboratorium till nästa. Därför är det sällan relevant att rapportera fabrikat av centrifug, typ av rotor, eller hastighet.
centrifugeringsprocessen
centrifugering ger en centripetalkraft som kan vara många hundratals eller tusentals gånger tyngdkraften, vilket påskyndar processen avsevärt. Ju större antal varv per minut (RPM) desto större är tyngdkraften. Användbarheten av centrifugering i cellfraktionering skulle vara begränsad om allt vi kunde göra är att driva suspenderade partiklar till botten av ett rör. Utredare kan dock kontrollera storleken på partiklar som sänks tack vare partiklarnas fysik i suspension.
i en suspension av runda partiklar med samma densitet men olika diametrar är kraften som driver en given partikel till botten lika med dess massa gånger den applicerade accelerationen. Partikelns volym är en funktion av dess radie, och dess massa är lika med dess volym gånger dess densitetskoefficient, vilket är en konstant. Volymen av en sfär är lika med 4/3 gånger pi (en konstant) gånger kuben av radien. För en suspension av sfäriska partiklar med lika densiteter under en specifik uppsättning förhållanden är den enda variabeln som bestämmer kraften på en given partikel dess radie.
motståndet mot rörelse genom en lösning är proportionellt mot den del av ytan som skjuter genom mediet. För partiklar av liknande form möter mindre partiklar mindre motstånd än större. Eftersom ytan på en sfär är 4 gånger pi gånger radiens kvadrat och 4 gånger pi är en konstant, då för sfäriska partiklar med lika sammansättning, är den enda variabeln som bestämmer motståndet under en given uppsättning förhållanden partikelns radie.
drivkraften ökar proportionellt till radiens kub. Motståndet mot rörelse ökar proportionellt mot radiens kvadrat. Det är inte svårt att se att när partikelns radie ökar ökar dess tendens att närma sig botten också. Lägg till en betydande mängd drag, och gravitationsexperimentet som har tillskrivits Galileo fungerar inte så bra, trots allt. Eftersom stora partiklar sediment snabbare än små partiklar, kan en utredare separera Stora från små organeller, celler, etc. helt enkelt genom att styra tid och varvtal för en centrifugkörning.
fraktionering genom differentialcentrifugering
För ett typiskt cellhomogenat, a 10 min. spin vid låg hastighet (400-500 x g) ger en pellet bestående av obruten vävnad, hela celler, cellkärnor och stora skräp. Låghastighetspelleten kallas traditionellt kärnpelleten. En 10 min. spin med en måttligt snabb hastighet, vilket ger krafter på 10 000 till 20 000 x g sänker mitokondrier tillsammans med lysosomer och peroxisomer. Därför kallas den andra pelleten i det traditionella cellfraktioneringsschemat mitokondriell pellet.
ytterligare cellfraktionering genom differentialcentrifugering kräver användning av en ultracentrifuge. Ett sådant instrument är utformat för att snurra rotorer vid höga vinkelhastigheter för att generera mycket höga G-krafter. Luften måste pumpas ut ur kammaren för att undvika värmeuppbyggnad på grund av luftfriktion. Faktum är att många rotorer som är konstruerade för en ultracentrifuge inte ens byggs aerodynamiskt, eftersom de spinns i vakuum. En timmes höghastighets ultracentrifugkörning som genererar en kraft i storleksordningen 80 000 x g ger en mikrosomal pellet. Mikrosomer innefattar fragment av membran, inklusive cellmembran och endoplasmatisk retikulum. Membranfragment bildar vesiklar när de störs i ett vattenhaltigt medium, så undersökning skulle avslöja många membranvesiklar av olika storlekar. Vesiklarna själva kan separeras på basis av densitet på grund av varierande proteininnehåll. Men det är ett ämne för ett annat dokument.
Snurra i flera timmar vid 150 000 x g eller så, och du kan ta ner ribosomer och till och med den största av makromolekyler. Supernatanten som återstår består av lösliga komponenter i cytoplasman, inklusive salter, små makromolekyler och prekursormolekyler och upplösta gaser.