resistensmekanismen för Escherichia coli inducerad av ampicillin i laboratoriet

introduktion

patogen Escherichia coli orsakar ofta diarre, sepsis och andra kliniska symtom och är fortfarande en av de viktigaste tarmpatogenerna som påverkar människors och djurs hälsa. Ampicillin (AMP), ett halvsyntetiskt antibiotika för att behandla E. coli-infektion hos människor och boskap, men nyligen har dess resistensgrad ökat.1-3 AMP fungerar på det aktiva replikeringsstadiet av bakterier, vilket hämmar syntesen av bakteriell cellvägg. Bakterier motstår ofta en sådan antibiotika på följande sätt: kodar för Bisexuell-laktamas, ändrar målproteinet i cellväggen, minskar permeabiliteten hos yttre membran, och ökar uttrycket av läkemedels utflödespump. Antibakteriella läkemedel används av djur och sprids sedan till miljön via excreta, vilket inte bara gör miljön förorenad utan också skadar människors hälsa och den hållbara utvecklingen av avelsindustrin.4,5

helgenomsekvensering (WGS) har visat sig vägleda förebyggande och kontroll av bakteriell resistens.6 enkel nukleotidpolymorfism (SNP) hänvisar huvudsakligen till DNA-sekvenspolymorfism orsakad av variationen av en enda nukleotid på genomisk nivå, och resekvenseringsanalysen för att screena de olika SNP: erna kan mer direkt studera läkemedelsresistens. Vi simulerade processen med kliniska antibiotika i organismer genom att använda metoden för AMP-laboratorieinduktion och undersökte förhållandet mellan graden av läkemedelsresistens och mutationsstället. Screening för icke-synonymt enkel nukleotidpolymorfism (icke-SNP) mellan läkemedelsresistenta och mottagliga stammar för att förstå rollen som icke-SNP i läkemedelsresistenta stammar. Syftet med denna studie är att förstå lagen och mekanismen för läkemedelsresistens hos E. coli, ge nya mål för utveckling av nya antibiotika, göra rationell användning av antibiotika och lösa multipel förekomst och behandling av multiläkemedelsresistens hos E. coli i klinisk praxis.

material och metoder

bakterieisolat och reagens

E. coli-stammen som användes i denna studie (E. coli 15743) isolerades från ett avföringsprov från en patient på ett sjukhus i Suixian, Henan-provinsen, Kina, 2015. Karakterisering av denna stam av Kirby Bauer (K-B) pappersdiffusionsmetod visade att stammen var känslig för åtta klasser av 20 antibiotika. E. coli ATCC 25922 användes som kontroll för vår studie.

m-h buljongmedium och m-h fast medium (Oxoid company, Storbritannien), farmaceutiskt känsligt papper (Hangzhou Binhe microbial company, Hangzhou, Kina), AMP-standardprodukter (kinesiskt läkemedelsidentifieringsinstitut, Peking, Kina), DNA-extraktionssats (Shanghai Laifeng Biotech company, Shanghai, Kina). Illumina Hiseq gjordes på Shanghai Lingen Biotechnology Co., Ltd.

E. coli som användes i experimentet isolerades specifikt för denna studie. Studien godkändes av Life Science Ethics Committee vid Zhengzhou University, och patienten undertecknade också skriftligt informerat samtycke.

Induktionsprocess

minsta hämmande koncentration (MIC) bestämdes med mikrobrotts utspädningsmetod.7-9 stammen av E. coli (isolerad från klinisk och har MIC-värde) som är känslig för AMP odlades i MH fast medium, 37 msk C kultur efter 18-24 timmar, plocka en enda koloni i 8 mL m-h flytande medium för förstärkning av bakterier. Ovanstående bakterielösning odlades i M – h flytande medium innehållande 1/2mic AMP, respektive, och koncentrationen av AMP ökades kontinuerligt under subkulturprocessen. När koncentrationen av antibiotika nådde 16 kg/mL ökade 8 kg/mL varje gång och varje koncentration subkulturerades två gånger. När värdet på MIC-förändringen av ett läkemedel var större än eller lika med fyra gånger MIC före och efter induktion ansågs det att MIC-förändringen efter induktion hade betydande betydelse.10 odlingsmediet för M-H-buljong utan antibiotika användes som kontroll under hela processen.

Multilocus sekvens typning (MLST) av E. coli-stammar klassificerades av sju par hushållningsgener innehållande adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA och recA.

Känslighetstestning

Kirby Bauer-pappersdiffusionsmetod användes för att screena E. coli som var känslig för åtta typer av antibiotika, inklusive aminoglykosider, penicilliner, cefalosporiner, tetracyklin, tuberkulo-laktamashämmare, karbamater, sulfonamider och kinoloner. De inducerade stammarna upprepades med användning av läkemedelskänslighetstest. Datatolkningen utfördes i enlighet med riktlinjerna för Clinical and Laboratory Standards Institute 2016.11

först inducerade vi E. coli-resistens mot AMP, genom att odla E. coli med gradvis ökning av koncentrationen av AMP (2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, och 256 occurg / mL). Efter att vi erhållit resistensstam jämförde vi resistensspektrumet för 20 antibiotika mellan den inducerade stammen (E. coli 15743-256, inducerad vid 256 oc/mL) och den ursprungliga stammen (E. coli 15743) genom att utföra läkemedelskänslighetstester. Den bakteriella suspensionen spreds på en agarplatta, med en liten cirkulär bitar papper innehållande olika antibiotika, och odlades vid 37 C i 16-20 timmar. Antimikrobiell Ringdiameter mättes.

WGS och resequencing analysis

stammarna vid MIC-värden på 32 och 256 namngavs som E. coli 15743-32 respektive E. coli 15743-256. Helgenomanalys utfördes på de primära känsliga stammarna och resequencing utfördes på inducerade resistenta stammar. Resultaten av resequencing jämfördes med de på den ursprungliga kartan. Screening av icke-SNP som kan påverka proteinfunktionen.

sekvensering utfördes av Shanghai ling ’ en Biotechnology Co. Ltd. (Shanghai, Kina). Illumina Hiseq kombinerat med tredje generationens sekvenseringsteknik användes för att slutföra genomisk sekvensering av stammarna i detta projekt.

RT-PCR

Ta bort det omvända transkriberade DNA: t från frysen 4 c c och förbered den önskade koncentrationen av reagenset enligt anvisningarna. Slå på ABI Fast7500 instrument, ställa 95°C i 30 s, reagerar för 40 cykler, 95°C i 3 s, 60°C i 30 s och lös upp kurvan för 95°C i 15 s, 60°C i 60 s, och 95°C i 15 s. Lägg provet till 8-rad EP-röret, tre replikerade brunnar per prov och ta bort bubblorna genom centrifugering. Det genomsnittliga CT-värdet för varje prov registrerades efter att reaktionen var klar. Den relativa expressionsnivån för genen av intresse beräknades med användning av 2-UCC. (USC = CT-värdet av målgenen-CT-värdet av den interna referensgenen. ΔΔCT = experimentella prov ΔCT – kontroll grupp ΔCT.)

bioinformatikanalys

Schweizisk modellprogramvara användes för att analysera aminosyrasekvensen för proteinet kodat före och efter genmutation och förutsäga proteintertiär struktur.12,13

statistisk analys

SPSS17.0 användes för enkel linjär regressionsanalys och regressionsekvationen testades. Storleken på ett test var 0,05 (2,05=0,05).

resultat

testresultat för läkemedelskänslighet

våra data visade att E. coli 15743 var känslig för 20 olika antibiotika. Efter induktion, E. coli 15743-256 var resistent mot AMP, piperacillin, cefuroxim, cefazolin, cefoxitin, AMP/sulbactam, amoxicillin/klavulansyra, piperacillin/tazobactam och aztreonam, men fortfarande känslig för återstående 11 antibiotika (Tabell 1, notera att mellanhänder också definierades som läkemedelsresistens). Våra resultat indikerade att originalkänslig E. coli inte bara inducerades resistent mot AMP, men också resistent mot en mängd andra antibiotika och blev Multi-läkemedelsresistent under induktion.

tabell 1 Antibakteriell Ringdiameter av Escherichia coli

förekomsten av läkemedelsresistens (bestämd av MIC-värde) under induktion

för att studera kinetik av läkemedelsresistens odlade vi E. coli med ökande koncentration av AMP under olika perioder och uppmätt mic vid varje koncentration som anges i tabell 2. Regressionsanalys utfördes på MIC-värdet och induktionstiden med SPSS 17.0. Regressionsekvationen var y=1,0435 lnx−0,7316. Den passande effekten av ekvationen utvärderades, R2=0,9605, P<0,05. MIC-värdet som når 32 kg / mL är det kritiska värdet och MIC-värdet ökade snabbare innan det når 32 kg/mL än efter (Tabell 2).

tabell 2 MIC-värdet för E. coli 15743 över tid och inducerad koncentration

under tiden valdes delen med MIC-värde mindre än eller lika med 32 occlg/mL för regressionsanalys, och regressionsekvationen var y=0,0358 x+1,2812. Den passande effekten av ekvationen utvärderades, R2=0,991, P<0,05. MIC-värdet för E. coli 15743 ökade med ökningen av induktionskoncentration och induktionstid (Figur 1).

Figur 1 förändringen av MIC-värde över tiden.Förkortning: MIC, minsta hämmandekoncentration.

mlst-resultat

för att visa att den inducerade stammen (E. coli 15743-256) verkligen härleddes från den ursprungliga stammen (E. coli 15743) utförde vi mlst över två stammar. Genomiskt DNA extraherades genom bakteriell DNA-extraktionssats, PCR amplifierades och sekvenserades av Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Blast sökning av NCBI databas indikerade att dessa två stammar har identiska, MLST typ, adk-13, fumC-363, gyrB-302, icd-97, mdh-17, purA-94, och recA-93. Våra data indikerar att induktionsprocessen inte var förorenad och den resistenta stammen E. coli 15743-256 härleddes från den känsliga stammen E. coli 15743.

helgenomanalys

E. coli 15743 innehöll 4408 gener, 22 rRNA och 85 tRNA. Gentätheten var 0,945 kb, GC-innehållet var 51.7%, genprocenten var 88,3%, den intergena regionlängden var 545 151, den intergena regionen GC-innehållet var 42,6% och den intergena regionen stod för 11,7% av genomet. Egenskaperna hos E. coli 15743 genom sammanfattas i Figur 2. E. coli 15743 innehöll inte plasmider.

Figur 2 den genomiska kartan över E. coli 15743.Anmärkningar: Den yttersta cirkeln på cirkelkartan är den genomstora logotypen, varje skala är 0,1 Mp. Den andra och tredje cirkeln är CD-skivor på de positiva och negativa kedjorna, och de olika färgerna indikerar olika COG-klassificeringar av CD-skivorna. Den fjärde cirkeln är rRNA eller tRNA. Den femte cirkeln är GC-innehållet, och den yttre röda delen indikerar att GC-innehållet i regionen är högre än hela genomets genomsnittliga GC-innehåll. Ju högre toppvärdet indikerar desto större är skillnaden från det genomsnittliga GC-innehållet, och den inre blå delen indikerar att GC-innehållet i regionen är lågt. För hela genomets genomsnittliga GC-innehåll indikerar en högre topp en större skillnad från det genomsnittliga GC-innehållet. Den innersta cirkeln är GC skevvärdet. Den specifika algoritmen är G-C eller G+C. När värdet är positivt i biologisk mening tenderar den positiva kedjan att transkribera CD-skivor. När det är negativt tenderar den negativa kedjan att transkribera CD-skivor.Förkortning: COG, kluster av Ortologa Grupperav proteiner.

stamens genomkarta innefattar fördelning av gener på rättvisa och antisens kedjor, funktionell klassificering av kluster av Orthologa grupper av proteiner (COG), GC-innehåll, genomö och homologa gener, som helt kan visa genomets egenskaper.

COG

den funktionella klassificeringen av COG av E. coli 15743 visade att de flesta gener var relaterade till aminosyratransport och metabolism, kolhydrattransport och metabolism, energiproduktion och omvandling, endast allmän funktionsprognos, oorganisk jontransport och metabolism och cellhöljebiogenes (Figur 3).

Figur 3 den funktionella klassificeringen av kugge av E. coli 15743.Förkortning: COG, kluster av Ortologa grupper av proteiner.

icke-SNPs

för att bestämma om det var en förändring i E. coli-genomet efter induktion av den ursprungliga stammen utförde vi en genomomfattande sekvensering av de inducerade resistenta stammarna (E. coli 15743-32 och E. coli 15743-256) och analyserade antalet mutationer och platsen för mutationen.

jämfört med den ursprungliga E. coli-stammen (E. coli 15743) fanns det nio icke-SNP i två inducerade läkemedelsresistenta stammar, inklusive tre delade icke-SNP, som var närvarande i generna orf00819, orf01200 och orf02235. Andra icke-SNP var närvarande i generna orf01916, orf00490, orf03479, orf04094. Tre icke-SNPs-mutationer inträffade i orf03479-genen, och endast en SNP-mutation inträffade i var och en av de återstående generna. Tre icke-SNP var i gener som kodar för cellmembranproteiner. Tre var i gener med okända funktioner. En var relaterad till transport och metabolism av oorganisk Jon, en var relaterad till transkription och en var relaterad till signaltransduktionsmekanismer (tabell 3).

tabell 3 icke-SNPs-analysresultaten för E. coli 15743-32 och E. coli 15743-256

våra data visade att det fanns fyra icke-SNP i E. coli 15743-32, som var på fyra gener. Det fanns åtta icke-SNP i E. coli 15743-256, spridda över sex gener. Den funktionella klassificeringen av COG visade att de flesta gener var relaterade till aminosyratransport och metabolism, kolhydrattransport och metabolism, energiproduktion och omvandling, endast allmän funktionsprognos, oorganisk jontransport och metabolism och cellhöljebiogenes.

RT-PCR

hela genomet re-sekvensering E. coli 15743-32 och E. coli 15743-256, fluorescerande realtid kvantitativ PCR-detektion av konsensusgener. Generna i vilka icke-SNP förekommer screenades och E. coli 15743-32 och E. coli 15743-256 hade tre identiska gener (orf00819, orf01200, orf02235), och uttrycksnivåerna för dessa gener i varje generationsstam visas i Figur 4A–C, respektive.

Figur 4 resultat av mRNA-uttryck i olika generationer av stammar.

RT-PCR visade att orf01200 -, orf00819 -, orf02235-generna visade högt uttryck i resistenta stammar (E. coli 15743-32, E. coli 15743-64, E. coli 15743-128, E. coli 15743-256).

proteinstruktur förutsägelse

den tertiära strukturen ändras endast i proteiner kodade av gener orf01200 och orf04094, och de förutsagda resultaten visas i figurerna 5 och 6.

Figur 5 den tertiära strukturen hos proteinet kodat genom orf01200 gen.Anmärkningar: (A) före mutationen; (B) efter mutationen.

figur 6 den tertiära strukturen hos proteinet kodat av orf04094-genen.Anmärkningar: (A) före mutationen; (B) efter mutationen.

före mutationen av orf01200, 2hrt.1.A valdes som referensmallprotein (figur 5A). Modellutbudet för restinfrastruktur var 2-1033, sekvenslikheten var 0.59, och mallen täckningen var 1.00. Efter mutationen av orf01200, 1iwg.1.A valdes som referensmallprotein (figur 5B). Modellutbudet för restinfrastruktur var 7-1036, sekvenslikheten var 0,59 och malltäckningen var 1,00.

före mutationen av orf04094, 4cti.1.B valdes som referensmallprotein (figur 6A). Modellutbudet för restinfrastruktur var 184-436, sekvenslikheten var 0,56 och malldäckningen var 0,59. Efter mutationen av orf04094, 3ib7.1.A valdes som referensmallprotein (figur 6B). Modellutbudet för restinfrastruktur var 10-262, sekvenslikheten var 0,33 och malldäckningen var 0,91.

diskussion

regressionsanalys av MIC och induktionstid visade att mic-värdet på stammen ökade med ökningen av exogent antibiotikatryck och induktionstiden. Liu et al, visade att under induktionen av E. coli-resistens av imipenem ökade MIC-värdet med tiden.14 även när den inducerade koncentrationen nådde 128 gånger MIC-värdet för den primära stammen fortsatte induktionen och MIC-värdet fortsatte att öka med induktion. I överensstämmelse med resultaten av denna studie ökade MIC-värdet av E. coli med tiden och inducerad koncentration. Det visar att om dosen inte är begränsad kommer stammens motstånd att bli mer och mer allvarlig.

AMP inducerades till E. coli 15743 under 63 timmar (MIC nådde 32 kg/mL) och MIC-värdet var åtta gånger det för den mottagliga stammen. Före detta ökade MIC-värdet snabbt, medan induktionen fortsatte och tillväxten för MIC-värdet minskade när det inducerades till ett MIC-värde på 32 kg/mL. Med tanke på bakteriell resistens kan inträffa strax innan man når tröskelvärdet för läkemedelsresistens (MIC-värde på 32 occurg/mL). Efter att ha nått det kritiska värdet kan bakterierna vara lata och växa långsamt, men MIC-värdet fortsätter att öka. Man tror också att denna stam aktiverar vissa resistensmekanismer och förändrar bakteriens läkemedelsresistensstatus.

Zhang et al, visade att kloramfenikol inducerade känslig Shigella till det läkemedelsresistenta tillståndet, och dess läkemedelsresistensspektrum skulle förändras.10 som ett resultat var Shigella inte bara resistent mot kloramfenikol utan också resistent mot andra typer av antibiotika. I överensstämmelse med resultaten av denna studie förstärktes läkemedelsresistensspektrumet för E. coli efter induktion. Resultaten visade att E. coli 15743-256 var inte bara resistent mot AMP, men också mot piperacillin, cefuroxim, cefazolin, cefoxitin, AMP/sulbactam, amoxicillin/klavulansyra, piperacillin/tazobactam och aztreonam var också resistenta. Det anses att under induktionen av E. coli av AMP aktiveras Expressionssystemet för AcrAB-TolC, eller mer än ett av de multipla effluxpumpsystemen aktiveras, och det finns andra motståndsmekanismer än effluxmekanismen.

den molekylära mekanismen för bakteriell resistens är fortfarande oklar. För att undersöka den specifika molekylära mekanismen för E. coli-resistens mot AMP, bakteriell WGS-analys utfördes. Sekvenseringsresultaten jämfördes med referenssekvensen och 20 SNP screenades från sekvensen av E. coli 15743-32, varav 4 Var icke-synonyma SNP. Tjugosex SNP: er screenades från E. coli 15743-256-stammen, varav åtta var icke-synonyma SNP: er. Xiang et al, visade att resistensnivån för mutanta stammar var högre än för icke-mutanta stammar, och det fanns en kvantitativ reaktion mellan punktmutationer och bakterieresistensnivåer, och flera genmutationer kunde förbättra bakteriens resistens mot antibiotika.15 i överensstämmelse med resultaten från denna studie var antalet mutanta gener i E. coli 15743-32 mindre än E. coli 15743-256, vilket indikerar att antalet mutationer kan relateras till graden av läkemedelsresistens och ju fler mutationsställen desto högre grad av läkemedelsresistens.

Efter sekvensering distribuerades de icke-SNP som screenades i detta experiment i generna orf00490, orf00819, orf01916, orf01200, orf02235, orf03479 och orf04094. Bland dem är gener orf00490, orf00819 och orf01916 involverade i cellväggssyntes. Anteckningarna i KEGG är fumarat reduktas subenhet D (frdD), celldelningsprotein ftsI (penicillinbindande protein 3) respektive porin yttre membranprotein OmpD. Studier har visat att frd-genen kodar för ett FRD-enzym för att katalysera omvandlingen mellan fumaratreduktas och succinatdehydrogenas.16 Det har också visat sig att amplifiering av frdD-genen med användning av en plasmidvektor kan öka utbytet av bärnstenssyra.17,18 i kombination med denna studie anses det att frdD-genen är involverad i vissa metaboliska vägar, kanske associerade med AMP-resistens. I E. coli är de viktigaste målen för antibiotika med laktamantibiotika av typ BP1 (upprätthållande av cellmorfologi), PBP2 (upprätthållande av E. coli-spänning och stavform) och PBP3 (relaterat till bakteriedelning). PBP3 är en kärnkomponent i celldelningsproteiner som katalyserar tvärbindningen av cellväggpeptidoglykaner under celldelning.19-22 studier har visat att nedreglering av OmpD-protein och OmpD-genuttryck i bakteriella biofilmer leder till minskad cellmembranpermeabilitet och ökad resistens mot antibiotika.23,24 i överensstämmelse med resultaten av denna studie initierar OmpD-genmutationen en mekanism för bakteriell resistens mot antibiotika i form av antibiotika, och minskningen av E. coli-cellmembranpermeabilitet är en av orsakerna till ökad resistens mot AMP. Det anses att dessa förändringar i funktionen av proteiner kodade av gener som är involverade i cellväggssyntes påverkar bakteriens resistens mot AMP.

gener orf04094, orf01200, orf02235 kommenteras i KEGG som osmotisk trycksensor histidinkinas (envZ), multi-drug efflux pump gen (acrB) och multi-drug resistance protein involverat i transkriptionsreglering (marR). Under de senaste åren är den aktiva utflödesmekanismen den främsta orsaken till bakteriens multipla läkemedelsresistens.25-27 eftersom det mesta av avloppssystemet transporterar substrat i stor utsträckning, och många aktiva avloppssystem kan existera i samma bakterier, kan detta system leda till bakteriell resistens mot olika antibakteriella läkemedel med helt olika strukturer, nämligen multipel resistens. I Marlen Adlers studie ökade inte mutationer i ftsi-genen ensam antibiotikaresistens, medan ftsi-och envz-genmutationer ökade mic av antibiotika flera gånger. Cohen et al, visade att funktionen hos det hämmande proteinet kodat av den muterade MarR-genen skulle reduceras, och effekten av bakterierna på antibiotikas multipelresistens var liten när MarR-mutationen endast detekterades.28 Merric et al, fann att E. coli endast visade låga nivåer av multidrogresistens när MarR-genen muterades.29 resultaten av denna studie visade att flera gener samtidigt muterades och E. coli-resistens mot AMP ökade.

Gen orf03479 kommenteras som valin glycin upprepa g (VgrG) protein i KEGG. Typ VI-Sekretionssystemet (T6SS) är ett fagrelaterat system som finns i många bakteriepatogener, såsom E. coli, Pseudomonas aeruginosa och Burkholderia cenocepacia. Effektorfaktorerna kan utsöndras till extracellulära bakterier, och proteinsekretionssystemet är nära besläktat med virulens hos patogena bakterier. Wang Jianfeng et al, visade att VgrG-genmutation påverkar bakteriens toxicitet och läkemedelsresistens, men funktionen av glutamatvalinrepetitionsprotein är fortfarande oklart.30 Denna studie anser att vgrg-genen kan vara associerad med AMP-resistens, och dess mekanism behöver ytterligare undersökning.

Sammanfattningsvis är COG-funktionen hos dessa mutanta gener relaterad till cellmembranens ursprung, transport och metabolism av oorganiska joner, transkription och signaltransduktionsmekanismer. Studier har visat att bakterier under antibiotikaspänning kan ta både aktivt försvar och passivt försvar för att säkerställa deras överlevnad.31 i passivt försvar gör bakterier sig vilande, minskar livets vitalitet och blockerar kombinationen av antibiotika och mål för att minska antibiotikans dödande effekt. I aktivt försvar ökar de effluxpumpens aktivitet för att öka utflödet av antibiotika och minska ansamlingen av antibiotika i bakterier, vilket minskar antibiotikas dödande effekt på bakterier. Denna studie tyder på att resistansen hos E. coli till AMP är en kombination av aktiva försvarssystem och passiva försvarssystem. Läkemedelsresistens kan inträffa strax innan det bakteriella MIC-värdet når tröskelvärdet för läkemedelsresistens. Gener frdD, ftsI, acrB, OmpD, marR, VgrG och envZ är associerade med AMP-resistens. Dessa studier kommer att bidra till att förbättra den molekylära mekanismen för E. coli som är resistent mot antibiotika i form av antibiotika, och ge en forskningsbas för förebyggande och kontroll av multiresistenta bakterier och målen för nya antibiotika.