RNases är som baddie super-heroes bland laboratorieenzymer. De är allsmäktiga, destruktiva och till synes oförstörbara.detta beror på att de skapades av onda överherrar, för det enda syftet att göra livet svårt för de modiga forskarna som kämpar varje dag för att producera högkvalitativa, intakta RNA-preps.
Ok, jag skämtar om overlords-delen. Men varför har Rnaser alla dessa supermakter ändå? Och vad kan du göra för att besegra dem? Låt oss ta reda på det.
rnases superkrafter, förklarade.
Rnaser är allsmäktiga
detta är sant. Rnaser finns i alla celltyper och organismer från prokaryoter till eukaryoter. dvs de är överallt. Detta är en av de främsta anledningarna till att de är ett sådant problem i labbet. De flyter i luften, på varje yta av din kropp. Vilket innebär att de förorenar allt som luften eller någon yta på din kropp har berört. Vilket är i princip allt. Dessutom adsorberar RNase A i synnerhet mycket starkt till glas, vilket gör det ännu svårare att ta bort det från dina flaskor etc.
Rnaser är mycket destruktiva
Rnaser har i allmänhet en mycket hög specifik aktivitet mot deras substrat (RNA). Detta innebär att den minsta mängden RNAs lätt kan rippa genom dina dyrbara RNA-preps. För övrigt är detta också en av anledningarna till att ett RNAs (RNAs A) var det första enzymet som hade sin katalysmekanism härledd (Findlay et al 1962).
Rnaser är till synes oförstörbara
de visar en Phoenix-liknande återhämtning efter autoklavering
Convential wisdom säger att om du autoklaverar Rnaser, de denaturerar, men sedan renaturerar och återställer partiell funktion efter kylning. Denna fantastiska, mytomspunna styrka aktiveras av en serie intramolekylära disulfidbindningar som håller strukturen intakt, även efter att vätebindningarna som normalt håller 3D-proteinstrukturen på plats bryts. Liksom alla fabler är detta sant i viss utsträckning. Men läs vidare och vi kommer att ta reda på att denna speciella supermakt har hyped upp av spin läkare på RNase Baddies Inc.
även EDTA kan inte stoppa dem!
Till skillnad från andra nukleaser kräver många Rnaser inte metalljoner för katalys eftersom de använder 2-prime hydroxylgruppen i RNA-substratet som en reaktiv art, så att bara lägga till TE inte hämmar dem, som det skulle för DNA-munching nukleaser.
hur man besegrar de onda Rnaserna
oroa dig inte, medforskare. Rnaser kan vara formidabla fiender, men de har svagheter som vi kan utnyttja.
sparka dem i H: S
Rnaser är beroende av histidinrester på deras aktiva plats för katalys. Så dietylpyrokarbonat (DEPC), som är ett histidinspecifikt alkyleringsmedel, kan inaktivera dem. Autoklavering tar sedan bort DEPC för att stoppa det från att alkalisera andra proteiner i dig eller dina prover.
autoklavering fungerar, i en utsträckning
den mycket berömda oförstörbarheten av Rnaser inför autoklavering är sant i kärnan, men också mycket överhypad, som jag nämnde ovan. En trevlig liten studie från Ambion visade att Rnaser (eller RNase A åtminstone) inte är helt resistenta mot autoklavering. Snarare decimeras deras aktivitet genom autoklavering, men en liten del av RNAs-aktiviteten kvarstår efter autoklavering.
men om kursen en liten mängd RNAs fortfarande har en hel del RNA mumsa makt. Det betyder att rutinmässig autoklavering som en del av dina RNase – dekontamineringsprocedurer verkligen är värt-det är bara att du inte kan lita på det för att ta bort all aktivitet.
de tål inte (torr) värme
medan våt värme (autoklavering) delvis förstör Rnaser, finns det inget hopp om att de tål torr värme. Torr värme oxiderar Rnaser-alla andra proteiner, oavsett hur robusta de är. Så för rengöring av glasvaror bör ett par timmar vid 180 degC göra det.
kemisk krigföring
för rengöring av ytor, Rnaser, så robusta som de är, kan inte stå saker som väteperoxid, starka syror/baser, Trizol etc. Dessa används alla ofta för att bli av med även de tuffaste Rnaserna.
kryptonit för Rnaser: Inhibitorer
kanske är det bästa vapnet vi har i vår arsenal mot Rnaser Rnashämmare. Vanligtvis är kommersiella rnashämmare versioner av placenta ribonukleashämmare (RI). Som någon som spenderar ett år på att försöka perfekta RNA in situ hybridiseringar utan hjälp av en Rnashämmare (på grund av en falsk ekonomi av min chef!), Jag vet precis hur bra denna RNase Kryptonit är. En mikroliter av RI och plötsligt började mina experiment fungera.
Jag säger att detta är det bästa vapnet i vår arsenal mot RNases eftersom till skillnad från alla andra lösningar som anges ovan är RNase-hämmare specifika, så du kan (generellt) placera dem precis där det räknas i ditt arbetsflöde och få det skydd du behöver från de onda. Var inte utan det här om du arbetar med RNA.
har detta hjälpt dig? Vänligen dela med ditt nätverk.