Les RNases sont comme les super-héros méchants parmi les enzymes de laboratoire. Ils sont omnipotents, destructeurs et apparemment indestructibles.
C’est parce qu’ils ont été créés par des seigneurs maléfiques, dans le seul but de rendre la vie difficile aux courageux scientifiques qui se battent chaque jour pour produire des préparations d’ARN intactes de haute qualité.
Ok, je plaisante sur la partie overlords. Mais pourquoi les RNases ont-elles tous ces super-pouvoirs de toute façon? Et que pouvez-vous faire pour les vaincre? Découvrons-le.
Les super-puissances des RNases, expliquées.
Les RNases sont omnipotentes
C’est vrai. Les RNases se trouvent dans tous les types de cellules et organismes, des procaryotes aux eucaryotes. c’est-à-dire qu’ils sont partout. C’est l’une des principales raisons pour lesquelles ils posent un tel problème en laboratoire. Ils flottent dans l’air, sur toutes les surfaces de votre corps. Ce qui signifie qu’ils contaminent tout ce que l’air ou toute surface de votre corps a touché. Ce qui est fondamentalement tout. De plus, la RNase A en particulier s’adsorbe très fortement au verre, ce qui rend encore plus difficile son retrait de vos bouteilles, etc.
Les RNases sont très destructrices
Les RNases ont généralement une activité spécifique très élevée vis-à-vis de leur substrat (ARN). Cela signifie que la plus petite quantité de RNase peut facilement déchirer vos précieuses préparations d’ARN. Incidemment, c’est aussi l’une des raisons pour lesquelles une RNase (RNase A) a été la première enzyme à voir son mécanisme de catalyse déduit (Findlay et al 1962).
Les RNases sont apparemment indestructibles
Elles affichent une récupération de type Phénix après autoclavage
La sagesse conventielle dit que si vous autoclavez des RNases, elles se dénaturent, puis renaturent et reprennent une fonction partielle après refroidissement. Cette force incroyable et légendaire est rendue possible par une série de liaisons disulfures intramoléculaires qui maintiennent la structure intacte, même après la rupture des liaisons hydrogène qui maintiennent normalement la structure protéique 3D en place. Comme toutes les fables, cela est vrai dans une certaine mesure. Mais lisez la suite et nous découvrirons que ce super-pouvoir particulier a été exagéré par les spin doctors de RNase Baddies Inc.
Même l’EDTA ne peut pas les arrêter !
Contrairement à d’autres nucléases, de nombreuses RNases n’ont pas besoin d’ions métalliques pour la catalyse car elles utilisent le groupe hydroxyle 2-prime du substrat d’ARN comme espèce réactive, de sorte que le simple ajout de TE ne les inhibe pas, comme il le ferait pour les nucléases grignoteuses d’ADN.
Comment vaincre les RNases maléfiques
Ne vous inquiétez pas, collègue scientifique. Les RNases peuvent être des ennemis redoutables, mais elles ont des faiblesses que nous pouvons exploiter.
Les coupent dans les RNases H
s’appuient sur des résidus d’histidine dans leur site actif pour la catalyse. Ainsi, le pyrocarbonate de diéthyle (DEPC), qui est un agent alkylant spécifique de l’histidine, peut les inactiver. L’autoclavage retirera ensuite le DEPC pour l’empêcher d’alcaliniser d’autres protéines en vous ou dans vos échantillons.
L’autoclavage fonctionne, dans une certaine mesure
L’indestructibilité légendaire des RNases face à l’autoclavage est vraie au cœur, mais aussi très exagérée, comme je l’ai mentionné ci-dessus. Une belle petite étude d’Ambion a montré que les RNases (ou au moins la RNase A) ne sont pas complètement résistantes à l’autoclavage. Leur activité est plutôt décimée par l’autoclavage, mais une petite partie de l’activité de la RNase reste après l’autoclavage.
Mais si bien sûr une petite quantité de RNase a encore beaucoup de pouvoir grignotant l’ARN. Cela signifie que l’autoclavage de routine dans le cadre de vos procédures de décontamination de la RNase en vaut certainement la peine – c’est juste que vous ne pouvez pas compter sur elle pour supprimer toute l’activité.
Ils ne supportent pas la chaleur (sèche)
Alors que la chaleur humide (autoclavage) détruit partiellement les RNAses, il n’y a aucun espoir qu’elles résistent à la chaleur sèche. La chaleur sèche oxyde les RNAses – toute autre protéine, quelle que soit sa robustesse. Donc, pour nettoyer votre verrerie, quelques heures à 180 degC devraient le faire.
Guerre chimique
Pour nettoyer les surfaces, les RNAses, aussi robustes soient-elles, ne supportent pas des choses comme le peroxyde d’hydrogène, les acides / bases forts, le Trizol, etc. Ceux-ci sont tous couramment utilisés pour se débarrasser même des ARNASES les plus difficiles.
Kryptonite pour les RNases: Inhibiteurs
La meilleure arme que nous ayons dans notre arsenal contre les RNAses est peut-être les inhibiteurs de RNASES. Le plus souvent, les inhibiteurs de la RNase commerciale sont des versions de l’inhibiteur de la ribonucléase placentaire (IR). Comme quelqu’un qui passe un an à essayer de perfectionner des hybridations in situ d’ARN sans l’aide d’un inhibiteur de RNase (en raison d’une fausse économie de mon patron!), je sais à quel point cette Kryptonite RNase est bonne. Un microlitre de RI et soudain mes expériences ont commencé à fonctionner.
Je dis que c’est la meilleure arme de notre arsenal contre les RNases car contrairement à toutes les autres solutions énumérées ci-dessus, les inhibiteurs de RNASES sont spécifiques, vous pouvez donc (généralement) les placer là où cela compte dans votre flux de travail et obtenir la protection dont vous avez besoin contre les méchants. NE SOYEZ PAS sans ces trucs si vous travaillez avec de l’ARN.
Cela vous a-t-il aidé ? Ensuite, veuillez partager avec votre réseau.