O mecanismo de resistência de Escherichia coli induzidas pela ampicilina em laboratório

Introdução

Patogênicas de Escherichia coli, muitas vezes, provoca diarréia, sepse, e outros sintomas clínicos, e ainda é um dos principais patógenos intestinais que afetam a saúde humana e animal. Ampicilina (AMP), um antibiótico β-lactâmico semi-sintético, é amplamente utilizado no tratamento da infecção por E. coli humana e animal, mas recentemente sua taxa de resistência aumentou.1-3 AMP trabalha no estágio de replicação ativa das bactérias, inibindo a síntese da parede celular bacteriana. As bactérias resistem frequentemente a tais antibióticos das seguintes formas: codifica a β-lactamase, altera a proteína alvo na parede celular, reduz a permeabilidade da membrana exterior e aumenta a expressão da bomba de efluxo do fármaco. Os medicamentos antibacterianos são utilizados pelos animais e depois propagam-se ao ambiente através das excreções, o que não só polui o ambiente, como também causa grandes danos à saúde humana e ao desenvolvimento sustentável da indústria de reprodução.A sequenciação do genoma inteiro (WGS) com 4,5

mostrou guiar a prevenção e o controlo da resistência bacteriana.6 polimorfismo de nucleótidos únicos (SNP) refere-se principalmente ao polimorfismo de sequência de DNA causado pela variação de um único nucleótido no nível genômico, e a análise de ressequenciamento para rastrear os diferentes SNPs pode estudar mais diretamente a resistência ao fármaco. Simulamos o processo de antibióticos clínicos em organismos usando o método de indução laboratorial AMP, e exploramos a relação entre o grau de Resistência a medicamentos e o local de mutação. Rastreio do polimorfismo de nucleótidos únicos não sinónimos (non-SNP) entre estirpes resistentes ao fármaco e sensíveis para compreender o papel do não-SNP nas estirpes resistentes ao fármaco. O objetivo deste estudo é compreender a lei e o mecanismo de Resistência a drogas da E. coli, fornecer novas metas para o desenvolvimento de novos antibióticos, fazer o uso racional de antibióticos, e resolver a ocorrência múltipla e o tratamento da resistência multi-drogas da E. coli na prática clínica.materiais e métodos materiais

isolados bacterianos e reagente

a estirpe de E. coli utilizada neste estudo (E. coli 15743) foi isolado de uma amostra de fezes de um paciente de um hospital em Suixian, Província de Henan, China, em 2015. Caracterization of this strain by Kirby Bauer (K-B) paper diffusion method showed that the strain was sensitive to eight classes of 20 antibiotics. A E. coli ATCC 25922 foi usada como controlo para o nosso estudo.

M-H caldo médio e M-H sólido médio (Oxoid company, UK), farmacêutica sensitive paper (Hangzhou Binhe microbial company, Hangzhou, China), AMP standard products (Chinese drug identification Institute, Beijing, China), DNA extraction kit (Shanghai Laifeng Biotech company, Shanghai, China). Illumina Hiseq foi feito em Shanghai Lingen Biotechnology Co., Ltd.

A E. coli utilizada na experiência foi especificamente isolada para este estudo. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Ciências da vida da Universidade de Zhengzhou, e o paciente também assinou consentimento informado por escrito.o processo de indução

concentração inibitória mínima (CMI) foi determinado pelo método de diluição de microbro.7-9 a estirpe de E. coli (isolada a partir de valor clínico e com CIM) que é sensível à AMP foi cultivada em meio sólido MH, cultura de 37°C após 18-24 horas, escolher uma única Colónia em meio líquido de 8 mL M-H para amplificação de bactérias. A solução bacteriana acima foi cultivada em meio líquido M-H contendo AMP 1/2, respectivamente, e a concentração de AMP foi continuamente aumentada durante o processo de subcultura. Quando a concentração de antibióticos atingiu 16 µg/mL, aumentou de cada vez 8 µg/mL e cada concentração foi subculturada duas vezes. Quando o valor da mudança de MIC de uma droga foi maior ou igual a quatro vezes MIC antes e após a indução, considerou-se que a mudança de MIC após a indução tinha significância significativa.10 o meio de cultura do caldo M-H sem antibióticos foi usado como o controle durante todo o processo.tipagem de sequência Multilocus (MLST) de E. as estirpes de coli foram classificadas por sete pares de genes domésticos contendo adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA e recA.

teste de susceptibilidade

o método de difusão de papel de Kirby Bauer foi usado para rastrear a E. coli, que era sensível a oito tipos de antibióticos, incluindo aminoglicosidos, penicilinas, cefalosporinas, tetraciclina, inibidores da β-lactamase, carbamatos, sulfonamidas e quinolonas. As estirpes induzidas foram repetidas usando teste de sensibilidade ao fármaco. A interpretação dos dados foi realizada de acordo com as diretrizes clínicas e laboratoriais do Instituto de normas de 2016.Em primeiro lugar, induzimos resistência E. coli à AMP, através da cultura de E. coli com aumento gradual da concentração de AMP (2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, e 256 µg / mL). Após a obtenção da estirpe de resistência, comparámos o espectro de resistência de 20 antibióticos entre a estirpe induzida (E. coli 15743-256, induzida a 256 µg/mL) e a estirpe original (E. coli 15743) através da realização de testes de sensibilidade ao fármaco. A suspensão bacteriana foi espalhada sobre uma placa de ágar, com um pequeno papel circular contendo antibióticos diferentes, e cultivada a 37°C durante 16-20 horas. O diâmetro do anel antimicrobiano foi medido.

WGS e reordenação de análise

As cepas em valores de cim de 32 e 256 foram nomeados como E. coli 15743-32 e E. coli 15743-256, respectivamente. A análise do genoma total foi realizada nas estirpes sensíveis primárias e a ressequenciação foi realizada em estirpes resistentes induzidas. Os resultados da ressequenciação foram comparados com os do mapa original. Rastreio não-SNPs que possam afectar a função proteica.a sequenciação foi realizada pela Shanghai ling’en Biotechnology Co. Ltd. (Shanghai, China). Illumina Hiseq combinado com tecnologia de sequenciamento de terceira geração foi usado para completar a sequenciação genômica das estirpes neste projeto.

RT-PCR

retire o ADN transcrito reverso do congelador a 4°C e prepare a concentração desejada do reagente de acordo com as instruções. Ligar o instrumento ABI Fast7500, ajustar 95 ° C para 30 s, reagir durante 40 ciclos, 95°C para 3 s, 60°C para 30 s, e dissolver a curva para 95°C para 15 s, 60°C Para 60 s e 95°C para 15 s. Adicionar a amostra ao tubo EP de 8 linhas, três alvéolos replicados por amostra e remover as bolhas por centrifugação. O valor médio da TC de cada amostra foi registado após a conclusão da reacção. O nível de expressão relativa do gene de interesse foi calculado usando 2-ΔΔCT. (ΔCT = valor CT do gene-CT-alvo do gene de referência interno. ΔΔCT = amostra experimental ΔCT-grupo de controlo ΔCT.)

Bioinformática análise

modelo suíço software foi usado para analisar a sequência de aminoácidos da proteína codificada antes e depois da mutação genética, e prever a estrutura terciária de proteína.12,13

A análise estatística

SPSS17.0 foi utilizada para a análise de regressão linear simples e a equação de regressão foi testada. O tamanho de um teste foi de 0,05 (α=0,05).resultados dos testes de sensibilidade ao fármaco

os nossos dados mostraram que a E. coli 15743 foi sensível a 20 antibióticos diferentes. Após a indução, E. coli 15743-256 era resistente à AMP, piperacilina, cefuroxima, cefazolina, cefoxitina, AMP/sulbactam, amoxicilina/ácido clavulânico, piperacilina/tazobactam, e aztreonam, mas ainda sensível aos restantes 11 antibióticos (Tabela 1, Nota que os Intermediários foram também definidos como resistência às drogas). Nossos resultados indicaram que a E. coli sensível original não só foi induzida resistente à AMP, mas também resistente a uma variedade de outros antibióticos e tornou-se multi-resistente durante a indução.

Tabela 1 Antibacteriano diâmetro do anel de Escherichia coli

A ocorrência de resistência às drogas (determinado pelo valor de MIC) durante a indução

Para estudar a cinética de resistência às drogas, nós culta E. coli com o aumento da concentração de AMP para diferentes períodos de tempo e medida do MIC em cada concentração, conforme indicado na Tabela 2. A análise de regressão foi realizada no valor da MIC e no tempo de indução utilizando SPSS 17.0. A equação de regressão foi y = 1,0435 lnx-0,7316. O efeito de ajuste da equação foi avaliado, R2=0,9605, P<0,05. O valor de CMI que atinge 32 µg/mL é o valor crítico e o valor de CMI aumentou mais rapidamente antes de atingir 32 µg/mL do que depois (Quadro 2).

a Tabela 2, O valor de MIC de E. coli 15743 ao longo do tempo e induzida concentração

Enquanto isso, a parte com MICROFONE valor menor ou igual a 32 µg/mL foi selecionada por análise de regressão, e a equação de regressão foi y=0.0358 x+1.2812. O efeito de ajuste da equação foi avaliado, R2=0,991, P<0,05. O valor MIC de E. coli 15743 aumentou com o aumento da concentração de indução e do tempo de indução (Figura 1).

a Figura 1, A mudança de MIC valor ao longo do tempo.Abreviatura: MIC, inibitiveconcentração mínima.

MLST resultados

Para demonstrar que a deformação induzida (E. coli 15743-256) foi, de fato, derivada da tensão original (E. coli 15743), realizamos MLST acima de dois cepas. O DNA genômico foi extraído por kit de extração de DNA bacteriano, PCR amplificado, e sequenciado por Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A pesquisa blástica na base de dados do NCBI indicou que estas duas estirpes têm o mesmo tipo MLST, adk-13, fumC-363, gyrB-302, icd-97, mdh-17, purA-94 e recA-93. Os nossos dados indicam que o processo de indução não foi contaminado, e a estirpe resistente E. coli 15743-256 foi derivada da estirpe sensível E. coli 15743.

análise do genoma inteiro

E. coli 15743 continha 4408 genes, 22 rRNA e 85 tRNA. A densidade genética era de 0,945 kb, o conteúdo de GC era de 51.7%, a porcentagem de genes foi 88,3%, o comprimento da região intergênica foi 545,151, o conteúdo da região intergênica GC foi 42,6%, e a região intergênica foi responsável por 11,7% do genoma. As características de E. coli 15743 genomas estão resumidas na Figura 2. E. coli 15743 não contém plasmídeos.

a Figura 2, O mapa genômico de E. coli 15743.Notas: o círculo mais externo do mapa do círculo é o logotipo do tamanho do genoma, cada escala é de 0,1 Mp. Os segundo e terceiro círculos são CDS sobre as cadeias positivas e negativas, e as diferentes cores indicam diferentes classificações COG dos CDS. O quarto círculo é rRNA ou tRNA. O quinto círculo é o conteúdo GC, e a parte vermelha externa indica que o conteúdo GC na região é maior do que o conteúdo GC médio de todo o genoma. Quanto maior o valor de pico indica maior a diferença em relação ao conteúdo médio de GC, e a porção azul interior indica que o conteúdo de GC na região é baixo. Para o conteúdo GC médio de todo o genoma, um pico mais elevado indica uma maior diferença em relação ao conteúdo GC médio. O círculo mais íntimo é o valor GC skew. O algoritmo específico é G−C ou G+C. Quando o valor é positivo no sentido biológico, a cadeia positiva tende a transcrever CDS. Quando é negativo, a cadeia negativa tende a transcrever CDS.Abreviatura: COG, Clusters of Orthologous group of proteins.

O mapa do genoma da estirpe inclui a distribuição dos genes nas cadeias de justiça e antisense, classificação funcional de Clusters of Orthologous Groups de proteínas (COG), GC conteúdo, genoma ilha, e genes homólogos, o que pode exibir completamente as características do genoma.

COG

a classificação funcional da COG de E. coli 15743 mostrou que a maioria dos genes estava relacionada com o transporte e metabolismo de aminoácidos, transporte e metabolismo de hidratos de carbono, produção e conversão de energia, apenas previsão da função geral, transporte de iões inorgânicos e metabolismo, e biogénese de envelope celular (Figura 3).

Figura 3, A classificação funcional da ENGRENAGEM de E. coli 15743.Abreviatura: COG, Clusters of Orthologous Groups of proteins.

Não-SNPs

Para determinar se houve uma alteração no genoma de E. coli após a indução da tensão original, foi realizada uma genome-wide seqüenciamento do induzida por cepas resistentes (E. coli 15743-32 e E. coli 15743-256) e analisado o número de mutações e o site da mutação.em comparação com a estirpe original de E. coli (E. coli 15743), houve nove Não-SNPs em duas estirpes resistentes ao fármaco induzidas, incluindo três não-SNPs comuns, que estavam presentes nos genes orf00819, orf01200 e orf02235. Outros não-SNPs estavam presentes nos genes orf01916, orf00490, orf03479, orf04094. Três mutações não-SNPs ocorreram no gene orf03479, e apenas uma mutação SNP ocorreu em cada um dos genes restantes. Três não-SNPs estavam em genes que codificam proteínas da membrana celular. Três estavam em genes com funções desconhecidas. Um foi relacionado ao transporte e metabolismo do íon inorgânico, outro foi relacionado à transcrição, e outro foi relacionado aos mecanismos de transdução de sinais (Tabela 3).

a Tabela 3 A não-SNPs resultados da análise de E. coli 15743-32 e E. coli 15743-256

os Nossos dados mostraram que não houve quatro não-SNPs em E. coli 15743-32, que estavam em quatro genes. Havia oito Não-SNPs na E. coli 15743-256, espalhados por seis genes. A classificação funcional da COG mostrou que a maioria dos genes estavam relacionados ao transporte e metabolismo de aminoácidos, transporte e metabolismo de carboidratos, produção e conversão de energia, apenas previsão de funções gerais, transporte de iões inorgânicos e metabolismo, e biogênese de envelope celular.

RT-PCR

re sequenciação do genoma total da E. coli 15743-32 e E. coli 15743-256, detecção quantitativa fluorescente de PCR em tempo real de genes consensuais. Os genes em que não ocorrem SNPs foram rastreados, e E. coli 15743-32 e E. a coli 15743-256 tinha três genes idênticos (orf00819, orf01200, orf02235) e os níveis de expressão destes genes em cada estirpe de geração são apresentados na figura 4A–C, respectivamente.

Figura 4-Resultados da expressão do mRNA em diferentes gerações de linhagens.

RT-PCR mostrou que o orf01200, orf00819, orf02235 genes mostrou alta expressão em linhagens resistentes (E. coli 15743-32, E. coli 15743-64, E. coli 15743-128, E. coli 15743-256).

previsão da estrutura proteica

a estrutura terciária muda apenas em proteínas codificadas por genes orf01200 e orf04094, e os resultados previstos são apresentados nas figuras 5 e 6.

Figura 5 A estrutura terciária da proteína codificada por orf01200 gene.Notas: A) antes da mutação; B) após a mutação.

Figura 6 A estrutura terciária da proteína codificada por orf04094 gene.Notas: A) antes da mutação; B) após a mutação.

Antes de mutação de orf01200, 2hrt.1.A foi selecionada como proteína modelo de referência (Figura 5A). A gama de modelos de infra-estrutura residual foi 2-1033, a semelhança de sequência foi 0.59, and the template coverage was 1.00. Após a mutação do orf01200, 1iwg.1.A foi selecionada como proteína modelo de referência (Figura 5B). A gama de modelos de infra-estrutura residual foi de 7-1036, a similaridade da sequência foi de 0,59, e a cobertura do modelo foi de 1,00.antes da mutação de orf04094, 4cti.1.B foi selecionada como proteína modelo de referência (Figura 6A). A gama de modelos de infra-estrutura residual foi de 184-436, a similaridade de sequência foi de 0,56, e a cobertura de modelo foi de 0,59. Após a mutação de orf04094, 3ib7. 1.A foi selecionada como proteína modelo de referência (Figura 6B). A gama de modelos de infra-estrutura residual foi de 10-262, a similaridade de seqüências foi de 0,33, e a cobertura do modelo foi de 0,91.

discussão

Análise de regressão da CIM e tempo de indução mostrou que o valor da CIM da estirpe aumentou com o aumento da pressão antibiótica exógena e o tempo de indução. Liu et al, mostrou que durante a indução da resistência de E. coli pelo imipenem, o valor de CIM aumentou com o tempo.Mesmo quando a concentração induzida atingiu 128 vezes o valor de MIC da estirpe primária, a indução continuou, e o valor de MIC continuou a aumentar com a indução. Consistente com os resultados deste estudo, o valor CMI da E. coli aumentou com o tempo e a concentração induzida. Mostra que, se a dose não for limitada, a resistência da estirpe tornar-se-á cada vez mais grave.

AMP foi induzido à E. coli 15743 durante 63 horas (a MIC atingiu 32 µg / mL) e o valor da MIC foi oito vezes superior ao da estirpe susceptível. Antes disso, o valor de CMI aumentou rapidamente, enquanto que quando induzido a um valor de CMI de 32 µg/mL, a indução continuou e a taxa de crescimento do valor de CMI diminuiu. Considerando que a resistência bacteriana pode ocorrer pouco antes de atingir o limiar de resistência ao fármaco (valor CMI de 32 µg/mL). Depois de atingir o valor crítico, as bactérias podem ser preguiçosas e crescer lentamente, mas o valor MIC continua a aumentar. Acredita-se também que esta estirpe activa certos mecanismos de resistência e altera o estado de resistência às drogas da bactéria.Zhang et al, mostraram que o cloranfenicol induzia Shigella sensível ao estado resistente à droga, e seu espectro de Resistência a drogas mudaria.Como resultado, Shigella não era apenas resistente ao cloranfenicol, mas também resistente a outros tipos de antibióticos. Consistente com os resultados deste estudo, o espectro de resistência ao fármaco da E. coli foi amplificado após indução. Os resultados mostraram que E. coli 15743-256 não foi apenas resistente à AMP, mas também para piperacilina, cefuroxima, cefazolina, cefoxitina, AMP/sulbactam, amoxicilina/ácido clavulânico, piperacilina/tazobactam, e aztreonam foram também resistentes. Considera-se que, durante a indução de E. coli por AMP, o sistema de expressão de AcrAB-TolC é activado, ou mais do que um dos sistemas de bomba de efluxo múltiplos é activado, e existem outros mecanismos de resistência para além do mecanismo de efluxo.o mecanismo molecular da resistência bacteriana ainda não é claro. A fim de investigar o mecanismo molecular específico de E. resistência coli A AMP, foi realizada a análise bacteriana de WGS. Os resultados de sequenciação foram comparados com a sequência de referência, e 20 SNPs foram rastreados a partir da sequência de E. coli 15743-32, 4 dos quais eram SNPs não sinônimos. 26 SNPs foram rastreados a partir da estirpe E. coli 15743-256, oito dos quais eram SNPs não sinônimos. Xiang et al, mostrou que o nível de resistência das estirpes mutantes era superior ao das estirpes não mutantes, e houve uma reacção quantitativa entre mutações pontuais e níveis de resistência bacteriana, e múltiplas mutações genéticas poderiam aumentar a resistência das bactérias aos antibióticos.Consistente com os resultados deste estudo, o número de genes mutantes na E. coli 15743-32 foi inferior a E. coli 15743-256, indicando que o número de mutações pode estar relacionado com o grau de resistência ao fármaco, e quanto mais locais de mutação, maior o grau de resistência ao fármaco.

Após o seqüenciamento, a não-SNPs projectado neste experimento foram distribuídos nos genes de orf00490, orf00819, orf01916, orf01200, orf02235, orf03479, e orf04094. Entre eles, genes orf00490, orf00819 e orf01916 estão envolvidos na síntese da parede celular. As anotações no KEGG são a subunidade da fumarato redutase D (frdD), a proteína ftsI da divisão celular (proteína de ligação à penicilina 3) e a proteína OmpD da membrana externa da porina, respectivamente. Estudos têm mostrado que o gene frd codifica uma enzima FRD para catalisar a conversão entre a fumarato redutase e a Succinato desidrogenase.Também se descobriu que a amplificação do gene frdD usando um vetor plasmídeo pode aumentar a produção de ácido succínico.17,18 em combinação com este estudo, considera-se que o gene frdD está envolvido em certas vias metabólicas, talvez associadas à resistência AMP. Na E. coli, os principais alvos dos antibióticos β-lactâmicos são PBP1 (mantendo a morfologia celular), PBP2 (mantendo a tensão e a forma da haste de E. coli) e PBP3 (relacionada com a divisão bacteriana). PBP3 é um componente principal das proteínas da divisão celular que catalisam a ligação cruzada dos peptidoglicanos da parede celular durante a divisão celular.19-22 estudos demonstraram que a redução da regulação da proteína OmpD e da expressão do gene OmpD nos biofilmes bacterianos conduz a uma diminuição da permeabilidade da membrana celular e a uma resistência acrescida aos antibióticos.De acordo com os resultados deste estudo, a mutação genética OmpD inicia um mecanismo de resistência bacteriana aos antibióticos β-lactâmicos, e a diminuição da permeabilidade da membrana celular de E. coli é uma das razões para o aumento da resistência à AMP. Considera-se que estas alterações na função das proteínas codificadas pelos genes envolvidos na síntese da parede celular afectam a resistência das bactérias à AMP.os Genes orf04094, orf01200, orf02235 são anotados em KEGG como o sensor de pressão osmótica histidina cinase (envZ), o gene da bomba de efluxo multi-fármaco (acrB) e a proteína de resistência multi-fármaco envolvida na regulação transcritional (marR). Nos últimos anos, o mecanismo de efluxo activo é a principal razão para a resistência múltipla das bactérias aos medicamentos.25-27 uma vez que a maioria do sistema de efluentes transporta substratos amplamente, e muitos sistemas de efluentes ativos podem existir na mesma bactéria, este sistema pode levar à resistência bacteriana a vários medicamentos antibacterianos com estruturas completamente diferentes, nomeadamente resistência múltipla. No estudo de Marlen Adler, as mutações no gene ftsI por si só não aumentaram a resistência aos antibióticos, enquanto as mutações do gene ftsI e envZ aumentaram a MIC de antibióticos várias vezes. Cohen et al, demonstrou que a função da proteína inibitória codificada pelo gene Marr mutado seria reduzida, e o efeito das bactérias na resistência múltipla dos antibióticos foi pequeno quando a mutação MarR foi apenas detectada.Merric et al, descobriu que a E. coli mostrou apenas baixos níveis de Resistência a vários fármacos quando o gene MarR sofreu uma mutação.Os resultados deste estudo demonstraram que múltiplos genes foram simultaneamente mutados e que a resistência da E. coli à AMP aumentou.o gene orf03479 é anotado como proteína G (VgrG) da glicina de valina repetida em KEGG. O sistema de secreção tipo VI (T6ss) é um sistema relacionado com fagos que existe em muitos patógenos bacterianos, tais como E. coli, Pseudomonas aeruginosa e Burkholderia cenocepacia. Os factores efectores podem ser secretados para o extracelular das bactérias, e o sistema de secreção de proteínas está intimamente relacionado com a virulência das bactérias patogénicas. Wang Jianfeng et al, mostrou que a mutação genética VgrG afeta a toxicidade e a resistência às drogas das bactérias, mas a função da proteína repetida de valina glutamato ainda não é clara.Este estudo considera que o gene VgrG pode estar associado à resistência AMP e que o seu mecanismo necessita de uma investigação mais aprofundada.

em resumo, a função COG destes genes mutantes está relacionada com a origem das membranas celulares, o transporte e o metabolismo dos iões inorgânicos, os mecanismos de transcrição e de transdução de sinais. Estudos têm mostrado que sob o stress antibiótico, as bactérias podem tomar defesa ativa e defesa passiva para garantir a sua sobrevivência.31 em defesa passiva, as bactérias tornam-se dormentes, reduzem a vitalidade da vida e bloqueiam a combinação de antibióticos e visam reduzir o efeito de matança dos antibióticos. Em defesa ativa, eles aumentam a atividade da bomba de efluxo para aumentar o efluxo de antibióticos e reduzir a acumulação de antibióticos em bactérias, reduzindo assim o efeito de matança de antibióticos em bactérias. Este estudo sugere que a resistência de E. coli a AMP é uma combinação de sistemas de defesa ativos e sistemas de defesa passiva. A resistência ao fármaco pode ocorrer pouco antes do valor da CIM bacteriana atingir o limiar de resistência ao fármaco. Os Genes frdD, ftsI, acrB, OmpD, marR, VgrG e envZ estão associados à resistência AMP. Estes estudos ajudarão a melhorar o mecanismo molecular da E. coli resistente aos antibióticos β-lactâmicos e fornecerão uma base de investigação para a prevenção e controlo de bactérias multirresistentes e dos alvos de novos antibióticos.