Si vous aviez suffisamment de temps et un environnement sans vibrations, vous pourriez attendre patiemment et la force de gravité amènerait la plupart des particules en suspension au fond d’un tube à centrifuger. Les plus petites particules resteraient probablement en suspension à cause du mouvement brownien, et la plupart des macromolécules seraient réparties uniformément car elles seraient en solution plutôt qu’en suspension. Je ne sais pas pour vous, mais je n’ai pas le genre de patience nécessaire pour compter uniquement sur la gravité pour séparer les composants solides des composants liquides. En outre, à des fins pratiques, le granule que vous avez obtenu serait beaucoup trop facilement perturbé pour une séparation efficace du matériau solide du surnageant. La gravité ne serait pas un moyen terriblement efficace de séparer les matériaux en suspension en fonction de la taille ou d’autres caractéristiques.
Description des conditions de centrifugation
Lors de la description d’un cycle de centrifugation dans des matériaux et des méthodes, il est rarement nécessaire de rapporter plus que la force, le temps et la température de la centrifugation. La vitesse requise (tr/min) dépend de la centrifugeuse et du rotor utilisés, qui varient d’un laboratoire à l’autre. Il est donc rarement pertinent de signaler la marque de la centrifugeuse, le type de rotor ou la vitesse.
Le processus de centrifugation
La centrifugation produit une force centripète qui peut être plusieurs centaines ou milliers de fois la force de gravité, accélérant ainsi considérablement le processus. Plus le nombre de tours par minute (TR / min) est élevé, plus la force de gravité est grande. L’utilité de la centrifugation dans le fractionnement cellulaire serait limitée si tout ce que nous pouvions faire était de conduire des particules en suspension au fond d’un tube. Cependant, les chercheurs sont en mesure de contrôler la taille des particules qui sont réduites, grâce à la physique des particules en suspension.
Dans une suspension de particules rondes de densité égale mais de diamètres différents, la force qui entraîne une particule donnée vers le bas est égale à sa masse multipliée par l’accélération appliquée. Le volume de la particule est fonction de son rayon et sa masse est égale à son volume multiplié par son coefficient de densité, qui est une constante. Le volume d’une sphère est égal à 4/3 fois pi (une constante) fois le cube du rayon. Pour une suspension de particules sphériques de densités égales dans un ensemble spécifique de conditions, la seule variable qui détermine la force sur une particule donnée est son rayon.
La résistance au mouvement à travers une solution est proportionnelle à la partie de la surface qui pousse à travers le milieu. Pour les particules de forme similaire, les particules plus petites rencontrent moins de résistance que les plus grandes. Puisque la surface d’une sphère est 4 fois pi fois le carré du rayon, et 4 fois pi est une constante, alors pour les particules sphériques de composition égale, la seule variable qui détermine la résistance dans un ensemble donné de conditions est le rayon de la particule.
La force motrice augmente proportionnellement au cube du rayon. La résistance au mouvement augmente proportionnellement au carré du rayon. Il n’est pas difficile de voir que lorsque le rayon d’une particule augmente, sa tendance à s’approcher du fond augmente également. Ajoutez une quantité importante de « traînée », et l’expérience de gravité qui a été attribuée à Galileo ne fonctionne pas si bien, après tout. Étant donné que les grosses particules sédimentent plus rapidement que les petites particules, un chercheur peut séparer les gros des petits organites, cellules, etc. simplement en contrôlant le temps et le régime d’un fonctionnement de la centrifugeuse.
Fractionnement par centrifugation différentielle
Pour un homogénéat cellulaire typique, 10 min. l’essorage à faible vitesse (400-500 x g) donne une pastille constituée de tissu ininterrompu, de cellules entières, de noyaux cellulaires et de gros débris. La pastille à basse vitesse est traditionnellement appelée pastille nucléaire. A 10 min. la rotation à une vitesse modérément rapide, produisant des forces de 10 000 à 20 000 x g fait tomber les mitochondries ainsi que les lysosomes et les peroxysomes. Par conséquent, la deuxième pastille du schéma de fractionnement cellulaire traditionnel est appelée pastille mitochondriale.
Le fractionnement ultérieur des cellules par centrifugation différentielle nécessite l’utilisation d’une ultracentrifugeuse. Un tel instrument est conçu pour faire tourner des rotors à des vitesses angulaires élevées, pour générer des forces g très élevées. L’air doit être pompé hors de la chambre afin d’éviter l’accumulation de chaleur due au frottement de l’air. En fait, de nombreux rotors conçus pour une ultracentrifugeuse ne sont même pas construits de manière aérodynamique, car ils sont filés sous vide. Une course d’ultracentrifugeuse à grande vitesse d’une heure qui génère une force de l’ordre de 80 000 x g donne une pastille microsomale. Les microsomes comprennent des fragments de membrane, y compris la membrane cellulaire et le réticulum endoplasmique. Les fragments de membrane forment des vésicules lorsqu’ils sont perturbés en milieu aqueux, de sorte que l’examen révélerait de nombreuses vésicules membranaires de différentes tailles. Les vésicules elles-mêmes peuvent être séparées sur la base de la densité, en raison de la teneur variable en protéines. Mais c’est un sujet pour un autre document.
Tournez pendant plusieurs heures à environ 150 000 x g, et vous pouvez faire tomber les ribosomes et même la plus grande des macromolécules. Le surnageant qui reste est constitué de composants solubles du cytoplasme, y compris des sels, de petites macromolécules et des molécules précurseurs, et des gaz dissous.